使用特异性引物PF111和PF112，生成pigX序列片段。为了完成pigX序列，用引物扩增在两条链上测序的两个独立产物。对完成的pigX序列进行组装，采用随机引物PCR和质子克隆方法确定了转座子Tn-DS1028在opgG突变体中的插入位点。将opgG：：Tn-DS1028突变体的基因组DNA进行自连接，得到含有opgG侧翼序列的质子pNRW98。PCR扩增pigX的不同结构域，并克隆到表达载体pQE-80L中。pigX基因扩增为两个片段。利用引物生成n端pigX片段和c端pigX片段。接下来，混合N端和c端片段，用引物对N端和c端片段进行第二次PCR。将pigX突变体的PCR片段用EcoRI和HindIII酶切，克隆到pQE- 80L。用引物从大肠杆菌ER2566的染色体DNA中扩增大肠杆菌蛋白YahA的EAL结构域，用SphI酶切，克隆到pQE-80L的SphI位点，构建pNRW94。
参考文献：Fineran PC, Williamson NR, Lilley KS, Salmond GP. Virulence and prodigiosin antibiotic biosynthesis in Serratia are regulated pleiotropically by the GGDEF/EAL domain protein, PigX. J Bacteriol. 2007 Nov;189(21):7653-62.
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使用特异性引物PF111和PF112，生成pigX序列片段。为了完成pigX序列，用引物扩增在两条链上测序的两个独立产物。对完成的pigX序列进行组装，采用随机引物PCR和质子克隆方法确定了转座子Tn-DS1028在opgG突变体中的插入位点。将opgG：：Tn-DS1028突变体的基因组DNA进行自连接，得到含有opgG侧翼序列的质子pNRW98。PCR扩增pigX的不同结构域，并克隆到表达载体pQE-80L中。pigX基因扩增为两个片段。利用引物生成n端pigX片段和c端pigX片段。接下来，混合N端和c端片段，用引物对N端和c端片段进行第二次PCR。将pigX突变体的PCR片段用EcoRI和HindIII酶切，克隆到pQE- 80L。用引物从大肠杆菌ER2566的染色体DNA中扩增大肠杆菌蛋白YahA的EAL结构域，用SphI酶切，克隆到pQE-80L的SphI位点，构建pNRW94。
参考文献：Fineran PC, Williamson NR, Lilley KS, Salmond GP. Virulence and prodigiosin antibiotic biosynthesis in Serratia are regulated pleiotropically by the GGDEF/EAL domain protein, PigX. J Bacteriol. 2007 Nov;189(21):7653-62.
