从酿酒酵母BY4741的基因组DNA中PCR扩增ILV2c、ILV5c、ILV3c、LEU9c、LEU1和LEU2。使用重叠延伸PCR去除LEU2基因中的内部BamHI限制性位点。所有PCR产物均用BamHI/XhoI消化，并插入质粒pδBLE2.0，得到质粒pδBLE2.0-ILV2c/ILV5c、pδBLE2.0-ILV3c/LUE9c和pδBLE2.0.LEU2/LUE1。将这些质粒作为模板，使用引物对Delta_IntF和Delta_IntR进行基因组整合盒PCR扩增，将纯化的PCR产物转化到BY4741中。为了基于质粒表达艾氏降解途径，从酿酒酵母BY4741的基因组DNA中PCR扩增了ARO10和ADH7基因。将ARO10基因的PCR产物用BamHI/XhoI消化，插入到具有多克隆位点修饰版本的pESC-URA衍生物中，得到pRS426-ARO10。将ADH7基因的PCR产物用BglII/XhoI消化，并插入用BamHI/XhoI切割的pRS426-ARO10中，得到质粒pRS426-ARO10/ADH7。对于基于质粒的蛋白质支架表达，从酿酒酵母BY4741的基因组DNA中PCR扩增ILV3c和LEU9c基因。用BamHI/HindIII消化ILV3c的PCR产物，用HindIII/XhoI消化LEU9c的PCR产物。将两个片段连接到用BamHI/XhoI切割的质粒pSH62中。将ILV3c和LEU9c融合在一起的质粒命名为pRS413-Scaf fold1。
参考文献：Yuan J, Mishra P, Ching CB. Engineering the leucine biosynthetic pathway for isoamyl alcohol overproduction in Saccharomyces cerevisiae. J Ind Microbiol Biotechnol. 2017 Jan;44(1):107-117.
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参考文献：Yuan J, Mishra P, Ching CB. Engineering the leucine biosynthetic pathway for isoamyl alcohol overproduction in Saccharomyces cerevisiae. J Ind Microbiol Biotechnol. 2017 Jan;44(1):107-117.
