通过两轮PCR，得到由靶位点的5’-上游区域(U)、选择启动子(P)和下游序列（D、ATF1的D-n端序列）组成的嵌合DNA片段。在第一轮PCR实验中，使用引物对（UF和UR对、PF和PR、DF和DR）从CLX14染色体DNA模板中独立扩增出U、P和D DNA片段。在第二轮PCR中，融合PCR中，重叠的序列作为引物，允许延伸到后续的嵌合产物。然后，以凝胶提取纯化的PCR产物，以引物UF、DR为模板，生成UPD全基因序列。将融合PCR产物经BamHI-KpnI双酶切，插入整合载体YIplac211中，得到质粒YIplac211-UPD。
参考文献：Dong J, Xu H, Zhao L, Chen Y, Zhang C, Guo X, Hou X, Chen D, Zhang C, Xiao D. Enhanced acetate ester production of Chinese liquor yeast by overexpressing ATF1 through precise and seamless insertion of PGK1 promoter. J Ind Microbiol Biotechnol. 2014 Dec;41(12):1823-8.
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通过两轮PCR，得到由靶位点的5’-上游区域(U)、选择启动子(P)和下游序列（D、ATF1的D-n端序列）组成的嵌合DNA片段。在第一轮PCR实验中，使用引物对（UF和UR对、PF和PR、DF和DR）从CLX14染色体DNA模板中独立扩增出U、P和D DNA片段。在第二轮PCR中，融合PCR中，重叠的序列作为引物，允许延伸到后续的嵌合产物。然后，以凝胶提取纯化的PCR产物，以引物UF、DR为模板，生成UPD全基因序列。将融合PCR产物经BamHI-KpnI双酶切，插入整合载体YIplac211中，得到质粒YIplac211-UPD。
参考文献：Dong J, Xu H, Zhao L, Chen Y, Zhang C, Guo X, Hou X, Chen D, Zhang C, Xiao D. Enhanced acetate ester production of Chinese liquor yeast by overexpressing ATF1 through precise and seamless insertion of PGK1 promoter. J Ind Microbiol Biotechnol. 2014 Dec;41(12):1823-8.
