以质粒pTrc99A的DNA为模板，通过引物扩增DNA片段1，使得PacⅠ、SpeⅠ和NdeⅠ酶切位点位于pTrc99A质粒lacI基因的前面，PacⅠ酶切位点位于转录终止子rrnB的后边。将片段1用DpnⅠ进一步酶切，并用T4多聚核苷酸激酶磷酸化。以质粒pTrc99A的DNA为模板，通过引物扩增DNA片段，DpnⅠ酶切，并在快连酶作用下与磷酸化的DNA片段1连接，转化大肠杆菌trans10感受态细胞，在含有终浓度为50μg/mL的氨苄青霉素LB培养基上过夜培养。提取质粒DNA，并用PacⅠ、BamHⅠ进行酶切验证。将正确的阳性克隆命名为pTrc99A-M。同样的方法，以质粒pACYC184的DNA为模板，通过引物184-F2/184-R2扩增DNA片段3，DpnⅠ酶切，并在快连酶作用下与磷酸化的DNA片段1连接，并用PacⅠ和BamHⅠ进行酶切验证。将正确的阳性的克隆命名为pACYC184-M。
参考文献：赵婧,刘怡,李清艳,朱欣娜,张学礼. 多个调控元件调控萜类合成途径基因表达提高β-胡萝卜素的生产[J]. 生物工程学报, 2013, 29(1): 41-55
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以质粒pTrc99A的DNA为模板，通过引物扩增DNA片段1，使得PacⅠ、SpeⅠ和NdeⅠ酶切位点位于pTrc99A质粒lacI基因的前面，PacⅠ酶切位点位于转录终止子rrnB的后边。将片段1用DpnⅠ进一步酶切，并用T4多聚核苷酸激酶磷酸化。以质粒pTrc99A的DNA为模板，通过引物扩增DNA片段，DpnⅠ酶切，并在快连酶作用下与磷酸化的DNA片段1连接，转化大肠杆菌trans10感受态细胞，在含有终浓度为50μg/mL的氨苄青霉素LB培养基上过夜培养。提取质粒DNA，并用PacⅠ、BamHⅠ进行酶切验证。将正确的阳性克隆命名为pTrc99A-M。同样的方法，以质粒pACYC184的DNA为模板，通过引物184-F2/184-R2扩增DNA片段3，DpnⅠ酶切，并在快连酶作用下与磷酸化的DNA片段1连接，并用PacⅠ和BamHⅠ进行酶切验证。将正确的阳性的克隆命名为pACYC184-M。
参考文献：赵婧,刘怡,李清艳,朱欣娜,张学礼. 多个调控元件调控萜类合成途径基因表达提高β-胡萝卜素的生产[J]. 生物工程学报, 2013, 29(1): 41-55
