为了克隆GAP启动子控制下的2,3-BD生物合成基因，用Bsp119I和EcoRI消化pGAPZαA以去除α信号序列，用DNA钝化酶钝化。将Te处理的片段自连接得到质粒pGAPZ。对alsS和alsD的序列进行密码子优化，将优化基因插入载体pUC57中，分别得到pUC57-alsS和pUC57-alsD。使用引物从pUC57-alsS中扩增alsS基因，将PCR产物用KpnI和SacII消化，并连接到用相同酶消化的pGAPZ中，以获得pGAPZ-alsS。将alsD克隆到pGAPZ中，使用EcoRI和KpnI以相同的方式得到pGAPZ-alsD。使用引物从蜡样芽孢杆菌基因组DNA中扩增2,3-丁二醇脱氢酶基因BDH1，并将其克隆到pGAPZ的EcoRI和KpnI之间，获得pGAPZ BDH1。用BamHI和BglII消化pGAPZ-AlsD，得到含有PGAP-AlsD-AOX1的片段。将pGAPZ-AlsS用BamHI线性化，与PGAP-AlsD-AOX1连接，得到质粒pGAPZ-SD。以相同的方式将BDH1克隆到pGAPZ SD中，得到pGAPZ-SDB。为了将通路基因整合到毕赤酵母基因组的HIS4位点，使用引物从毕赤酵母基因组中扩增HIS4基因。将HIS4克隆到pGAPZ-SD和pGAPZ-SDB中，分别得到pGAPZ-SDH和pGAPZ-SDBH。使用引物从大肠杆菌XL1基因组DNA中扩增大肠杆菌udhA基因。将udhA克隆到pGAPZ中，得到pGAPZ udhA，然后插入pGAPZ SD中获得pGAPZ SDU。将HIS4插入pGAPZ SDU中，得到pGAPZ-SDUH。
参考文献：Yang Z, Zhang Z. Production of (2R, 3R)-2,3-butanediol using engineered Pichia pastoris: strain construction, characterization and fermentation. Biotechnol Biofuels. 2018 Feb 12;11:35.
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为了克隆GAP启动子控制下的2,3-BD生物合成基因，用Bsp119I和EcoRI消化pGAPZαA以去除α信号序列，用DNA钝化酶钝化。将Te处理的片段自连接得到质粒pGAPZ。对alsS和alsD的序列进行密码子优化，将优化基因插入载体pUC57中，分别得到pUC57-alsS和pUC57-alsD。使用引物从pUC57-alsS中扩增alsS基因，将PCR产物用KpnI和SacII消化，并连接到用相同酶消化的pGAPZ中，以获得pGAPZ-alsS。将alsD克隆到pGAPZ中，使用EcoRI和KpnI以相同的方式得到pGAPZ-alsD。使用引物从蜡样芽孢杆菌基因组DNA中扩增2,3-丁二醇脱氢酶基因BDH1，并将其克隆到pGAPZ的EcoRI和KpnI之间，获得pGAPZ BDH1。用BamHI和BglII消化pGAPZ-AlsD，得到含有PGAP-AlsD-AOX1的片段。将pGAPZ-AlsS用BamHI线性化，与PGAP-AlsD-AOX1连接，得到质粒pGAPZ-SD。以相同的方式将BDH1克隆到pGAPZ SD中，得到pGAPZ-SDB。为了将通路基因整合到毕赤酵母基因组的HIS4位点，使用引物从毕赤酵母基因组中扩增HIS4基因。将HIS4克隆到pGAPZ-SD和pGAPZ-SDB中，分别得到pGAPZ-SDH和pGAPZ-SDBH。使用引物从大肠杆菌XL1基因组DNA中扩增大肠杆菌udhA基因。将udhA克隆到pGAPZ中，得到pGAPZ udhA，然后插入pGAPZ SD中获得pGAPZ SDU。将HIS4插入pGAPZ SDU中，得到pGAPZ-SDUH。
参考文献：Yang Z, Zhang Z. Production of (2R, 3R)-2,3-butanediol using engineered Pichia pastoris: strain construction, characterization and fermentation. Biotechnol Biofuels. 2018 Feb 12;11:35.
