从质粒pMEL5-39中获得酿酒酵母MEL5基因的EcoRI-SpeI片段，并与EcoRI-SpeI剪切的pBluescript II KS连接。用引物从基因文库中扩增PGK1启动子，使用SphI和XhoI酶插入MEL5 ORF上游，得到pMI234。用引物从基因文库中扩增GAPDH启动子，插入MEL5的上游得到pMI238。将pMI265中的BmLDH和G418R表达盒连接起来形成pMI278。将LhLDH基因和CYC1终止子的NcoI-BamHI与同样酶切的PGK1启动子或者TDH1启动子相连接，将LhLDH表达盒插入到pMI234中得到pMI246。PDC1的3’同源区域被插入LhLDH表达盒的下游区域，PDC1的5’同源区域被插入到MEL5标记区域的上游，得到 pMI257。从 pPIC9K中扩增G418R，连接到pNC101的PGK1启动子和终止子中间生成pMI260。将pMI265中的BmLDH和G418R表达盒连接起来形成pMI278。将PDC2的5’同源区域被插入到LDH表达盒的上游，PDC2的3’同源区域插入到表达盒下游，用BmLDH替代LhLDH，得到pMI286。
参考文献：Ilmén M, Koivuranta K, Ruohonen L, Rajgarhia V, Suominen P, Penttilä M. Production of L-lactic acid by the yeast Candida sonorensis expressing heterologous bacterial and fungal lactate dehydrogenases. Microb Cell Fact. 2013 May 25;12:53.
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从质粒pMEL5-39中获得酿酒酵母MEL5基因的EcoRI-SpeI片段，并与EcoRI-SpeI剪切的pBluescript II KS连接。用引物从基因文库中扩增PGK1启动子，使用SphI和XhoI酶插入MEL5 ORF上游，得到pMI234。用引物从基因文库中扩增GAPDH启动子，插入MEL5的上游得到pMI238。将pMI265中的BmLDH和G418R表达盒连接起来形成pMI278。将LhLDH基因和CYC1终止子的NcoI-BamHI与同样酶切的PGK1启动子或者TDH1启动子相连接，将LhLDH表达盒插入到pMI234中得到pMI246。PDC1的3’同源区域被插入LhLDH表达盒的下游区域，PDC1的5’同源区域被插入到MEL5标记区域的上游，得到 pMI257。从 pPIC9K中扩增G418R，连接到pNC101的PGK1启动子和终止子中间生成pMI260。将pMI265中的BmLDH和G418R表达盒连接起来形成pMI278。将PDC2的5’同源区域被插入到LDH表达盒的上游，PDC2的3’同源区域插入到表达盒下游，用BmLDH替代LhLDH，得到pMI286。
参考文献：Ilmén M, Koivuranta K, Ruohonen L, Rajgarhia V, Suominen P, Penttilä M. Production of L-lactic acid by the yeast Candida sonorensis expressing heterologous bacterial and fungal lactate dehydrogenases. Microb Cell Fact. 2013 May 25;12:53.
