实验步骤

1、从-80℃冰箱取出保存的农杆菌菌株，置于冰上，取少量迅速在LB平板（含抗生素）上划线，28℃培养2天；

2、挑取单菌落于5 ml液体LB培养基中（含抗生素），28 ℃ 200-250 rpm振荡培养过夜；

3、将4 ml过夜培养物加入100 ml新鲜配置的液体LB培养基中（无抗生素），28 ℃ 200-250 rpm振荡培养至OD600=0.5-0.6（约培养4-5 h）；

4、将培养物置于冰中30 min，然后4 ℃ 5000 rpm离心5 min，收集农杆菌；

5、用10 ml 0.15 M CaCl2溶液悬浮农杆菌，注意不要太剧烈；

6、4 ℃ 5000 rpm离心5 min，收集农杆菌。同时取10个1.5 ml离心管，置于冰上预冷；

7、用2 ml 20 mM CaCl₂溶液悬浮农杆菌，加入0.3 ml的无菌100%甘油，温和混匀，分装到预冷的离心管中，立即放入液氮速冻，于-80 ℃冰箱保存。