荧光蛋白标记技术

蛋白标记的主要目的是监测生物过程、辅助检测（例如化合物的可靠定量、蛋白质修饰的特异性检测）或者纯化标记后的蛋白及其结合对象。蛋白质的标记能够提高检测灵敏度以及简化检测工作流程。

目前有多种蛋白质标记技术来帮助我们研究感兴趣的蛋白质的丰度、位置、相互作用、翻译后修饰、功能，乃至监测活细胞中的蛋白质运输等问题。目前有多种类型的标记物和标记方式可供选择，但是针对特定的应用应当选择适合的标记策略。

no.1

代谢标记策略

代谢标记策略是一种体内标记方法，在这种方法中，细胞被“喂养”了化学标记的营养物，然后这些标记物被掺入新合成的蛋白质、核酸或代谢物中。然后，我们可以收集细胞并分离这些分子以获得细胞生物过程的全局视图。

• 蛋白同位素标记

原理：蛋白同位素标记是一种经典的蛋白示踪和蛋白组学定量技术，用天然同位素（轻型）或稳定同位素（重型）标记的必需氨基酸取代细胞培养基中相应氨基酸，这样细胞新合成的蛋白质可以在细胞生长期间通过掺入含有不同同位素的氨基酸进行标记。

• 其他蛋白质代谢标记物

原理：如果不具备质谱实验条件，那么可以使用基于生物正交反应的代谢标记方法。在生物正交系统中，细胞被“喂食”标记有一些对天然生物反应基团无反应的化学基团的分子结构单元。添加含有该基团的反应配偶体的外源性化合物引发化学反应，将标记的生物分子偶联至所需的官能团。

no.2

荧光标记策略

自发荧光蛋白、小分子荧光标志物染料、纳米晶体材料（即量子点材料）、小分子蛋白质标签等等这些材料都可以作为荧光标志物，结合荧光成像检测仪器可以对目标蛋白的表达情况、细胞中的定位情况、相互作用、活性状态等指标进行研究。

• 荧光蛋白标签

若将目的蛋白与荧光蛋白融合，则能够实现目的蛋白的细胞内观察，可用于多色标记和荧光共振能量转移（FRET）应用，用于可视化蛋白质与其他亚细胞结构的易位，研究蛋白质-蛋白质共定位，检测来自不同启动子的基因表达的开始，以及混合细胞群的分离。从早期的绿色荧光蛋白GFP发展到现在，我们已经拥有了覆盖多种光谱区域的荧光蛋白，包括绿色荧光蛋白、蓝色和蓝绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、橙色荧光蛋白、红色荧光蛋白，不同光谱型的荧光蛋白在亮度、光稳定性、分子大小上有所不同。

• 荧光染料蛋白体外标记

荧光染料标记蛋白或多肽技术是常见的蛋白体外标记技术，除了GFP等融合表达荧光蛋白之外，目标蛋白经过荧光染料标记可以直接进行活体示踪、细胞分选等下游实验操作。

原理：荧光标记所依赖的化合物称为荧光物质。荧光物质是指具有共轭双键体系化学结构的化合物，受到紫外光或蓝紫光照射时，可激发成为激发态，当从激发态恢复基态时，发出荧光。蛋白荧光标记技术利用荧光物质共价结合在目标分子的某个基团上，利用它的荧光特性来提供被研究对象的信息。

应用和特点：活化的荧光染料，例如FITC、7-氨基-4-甲基香豆素（AMC）、罗丹明B（RhodamineB）或AlexaFluor染料等，可用于标记抗体或蛋白功能基团，生成分子探针并通过荧光成像进行检测。当用荧光染料化学标记特异性抗体或其他纯化的生物分子时，它们成为用于检测靶抗原或相互作用配偶体的荧光探针，应用于细胞成像、流式细胞术、蛋白质印迹和酶联免疫吸附实验（ELISA）。因为荧光标记物具有无放射物污染、操作简便等优点，使其在蛋白功能研究、药物筛选等许多研究领域的应用日趋广泛。

• 蛋白量子点标记

原理：量子点（QuantumDots）是一种无机纳米结晶体，它可以根据其大小发出特定波长的荧光，它具有非常高的消光系数，其消光系数要比小分子荧光基团和荧光蛋白高出10~100倍，同时量子点的量子产率也很好。典型的量子点都含有一个CdSe或CdTe核心，外面包裹一硫化锌（ZnS）外壳。量子点的吸收波长范围覆盖从非常短的波长至略低于其发射波长的广阔范围，因此一束单波长激发光就可以让量子点达到多重发射。

应用和特点：目前研究出的水溶性量子点和油溶性量子点可以与抗体、链霉亲和素等分子进行偶联，应用于生物标记检测、高通量编码、活体成像及动态示踪等领域。不过结合了生物大分子的水溶性量子点体积较大（直径约10nm~30nm），从而阻碍了它通过细胞膜结构，因此只能用于经过透化处理的细胞，或者只能对胞外蛋白或可以被细胞内吞的蛋白进行研究。

no.3

其他标记策略

• 生物素标记

原理：生物素（Biotin）是蛋白质检测、纯化和固定的有用标签，因为它可以高亲和力地与链霉亲和素（Avidin）和链霉亲和素（Streptavidin，SA）结合。生物素-亲和素的亲和力至少比抗原-抗体结合力高百万倍，这种相互作用是蛋白质和配体之间最强的非共价相互作用之一。另外，生物素（MW=244.3Da）比酶标记物小得多，因此不太影响蛋白质本身的天然功能。总之，这些特征使得生物素-亲和素策略成为许多检测和固定应用的理想选择。

生物素化蛋白质是生物素与蛋白质共价结合的产物，因为生物素化蛋白质同时具备了高亲和力、高特异性和高灵敏度的优点，所以它提高了基于免疫方法的检测、纯化蛋白质技术的效率。

应用：生物素-亲和素系统广泛用于流式细胞术、荧光成像、蛋白质印迹和ELISA检测，以增加信号输出和更高的灵敏度。亲和素或链霉亲和素的荧光缀合物用于检测生物素化的生物分子。亲和素或链霉亲和素的酶缀合物，通常用于蛋白质印迹，ELISA和原位杂交成像应用。亲和素或链霉亲和素缀合的磁珠和树脂可用于分离蛋白质、细胞和DNA，也可用于免疫分析或生物筛检。

• 酶蛋白偶联物

以辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷脂酶（AP）为代表的酶标记物适用于与蛋白偶联并为免疫检测制备抗体偶联物。这两种标记物常被用于标记抗体后用作ELISA检测。

HRP适用于快速显色反应，ELISA检测中加入底物后在5~10min内即可到达OD450值1.8~2.5左右，而AP适用于慢速显色反应，其显色时间约4~8h，催化形成的黄色化合物比较稳定，比较适合酶促动力学的定量检测。