以酿酒酵母W303-1A染色体为模板，用引物对PGK基因进行PCR扩增，将PCR产物与质粒YEplac181同时使用限制性内切酶SacⅠ和KpnⅠ进行消化，使用T4连接酶进行连接，进行大肠杆菌DH5α转化，并利用CTAB法提取质粒获得YEplac181-PGK1p。以大肠杆菌DH5α基因组为模板，用引物对Lac基因进行PCR，以质粒p426-SNR52p-gRNA.CAN1.Y-SUP4t为模板，利用引物对CYC1t片段进行PCR。以得到的LacY片段和CYC1t片段共同为模板，用引物进行融合PCR，后将PCR产物与质粒YEplac181-PGK1p同时使用限制性内切酶KpnⅠ和BamHⅠ进行消化，使用T4DNA连接酶连接，转化至大肠杆菌中，并利用CTAB法提取质粒，得到质粒YEplac181-PGK1p/LacY-CYC1t，采用醋酸锂法转化酿酒酵母细胞。
参考文献：鲁尚昆,苏意德,邵文举,张爱利. 酿酒酵母异源表达纤维二糖转运蛋白LacY与纤维二糖利用菌株的构建. 微生物学报, 2023, 63(1): 170-180
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以酿酒酵母W303-1A染色体为模板，用引物对PGK基因进行PCR扩增，将PCR产物与质粒YEplac181同时使用限制性内切酶SacⅠ和KpnⅠ进行消化，使用T4连接酶进行连接，进行大肠杆菌DH5α转化，并利用CTAB法提取质粒获得YEplac181-PGK1p。以大肠杆菌DH5α基因组为模板，用引物对Lac基因进行PCR，以质粒p426-SNR52p-gRNA.CAN1.Y-SUP4t为模板，利用引物对CYC1t片段进行PCR。以得到的LacY片段和CYC1t片段共同为模板，用引物进行融合PCR，后将PCR产物与质粒YEplac181-PGK1p同时使用限制性内切酶KpnⅠ和BamHⅠ进行消化，使用T4DNA连接酶连接，转化至大肠杆菌中，并利用CTAB法提取质粒，得到质粒YEplac181-PGK1p/LacY-CYC1t，采用醋酸锂法转化酿酒酵母细胞。
参考文献：鲁尚昆,苏意德,邵文举,张爱利. 酿酒酵母异源表达纤维二糖转运蛋白LacY与纤维二糖利用菌株的构建. 微生物学报, 2023, 63(1): 170-180
