从 pRPF185克隆出slpA，在反向引物上包含一对BtgZI位点，并克隆到BamHI和XhoI位点。线性化质粒pVPL3004并插入一段包含pUC19复制起源的片段，利用引物对oJC195-oJC196进行定点诱变，去除pVPL3004的repE中的BtgZI位点。最后，用PCR对新穿梭载体主干的5.5kb片段进行线性化，并与含Ptet-Cas12a-thiT-T-2BtgZI的5.5kbPCR片段结合。
参考文献：Chua MJ, Collins J. Rapid, Efficient, and Cost-Effective Gene Editing of Enterococcus faecium with CRISPR-Cas12a. Microbiol Spectr. 2022 Feb 23;10(1):e0242721.
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利用CRISPR-Cas12a对屎肠球菌进行快速、高效、经济的基因编辑
从 pRPF185克隆出slpA，在反向引物上包含一对BtgZI位点，并克隆到BamHI和XhoI位点。线性化质粒pVPL3004并插入一段包含pUC19复制起源的片段，利用引物对oJC195-oJC196进行定点诱变，去除pVPL3004的repE中的BtgZI位点。最后，用PCR对新穿梭载体主干的5.5kb片段进行线性化，并与含Ptet-Cas12a-thiT-T-2BtgZI的5.5kbPCR片段结合。
参考文献：Chua MJ, Collins J. Rapid, Efficient, and Cost-Effective Gene Editing of Enterococcus faecium with CRISPR-Cas12a. Microbiol Spectr. 2022 Feb 23;10(1):e0242721.
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