为了构建用于过表达靶基因的质粒，将PtrpC-hph、 PtrpC-bar和PtrpC-neo分别克隆到pNA52-1N中形成pNA52-hph、pNA52-bar和pNA52-neo。将组成型tef1启动子和密码子优化的NP_594777融合并组装到pNA52-hph中形成过表达Spmae的质粒pPtrpC-Spmae-hph。将Te强组成型gpdA启动子插入pNA52-bar中生成质粒pAN52-PgpdA-bar。用引物从大肠杆菌基因组中扩增出Ecfum的开放阅读框。对Ckfum，Msfum和Rofum进行了密码子优化和人工合成，并克隆到pAN52-PgpdA-bar中，得到pAN52-pgpdA-A-pgpdA-Msfum-bar、pAN52-pgpdA-Ckpfum-bar和pAN52-PgpdA-Rofumbar。将扩增后的Peif和Mtsfc片段组装进pAN52-neo，获得质粒pPeif-Mtsfc-neo。使用sgRNACas9工具，以嗜热分枝杆菌基因组序列和靶基因为输入，鉴定了fr1、fr2、Mtfum、moc和Mtmae中的特异性sgRNA靶位点。选择脱靶概率低的寡核苷酸。用引物从U6p sgRNA质粒中扩增U6启动子和靶向sgRNA片段，通过重叠PCR组装，并克隆到pJET1.2/钝性克隆载体中，形成质粒U6-fr1-sgRNA、U6-fr2-sgRNA、U-6Mtfum-sgRNA、U6-moc-sgRNA和U6-Mtmae-sgRNA。用引物从嗜热分枝杆菌基因组中扩增出fr1、fr2和Mtfum的5′和3′侧翼片段并和选择性标记盒PtrpC-neo进行组装，克隆到用SpeI/EcoRV消化的pPK2BarGFPD中，产生供体DNA序列donor-fr1-neo、donor-fr2-neo和donor-Mtfum-neo。通过将TrpC的组成型启动子和选择性标记基因nat融合，得到PtrpC-nat。PtrpC-nat用引物扩增，与moc侧翼片段融合，并从嗜热分枝杆菌基因组中扩增Mtmae，插入pPK2BarGFPD中的SpeI/EcoRV之间，以产生供体DNA序列donor-moc-neo和donor-Mtmae-neo。

参考文献：Gu S, Li J, Chen B, Sun T, Liu Q, Xiao D, Tian C. Metabolic engineering of the thermophilic filamentous fungus Myceliophthora thermophila to produce fumaric acid. Biotechnol Biofuels. 2018 Dec 3;11:323.