使用引物扩增合成的NLS-Cas9-NLS、强组成型tef1启动子和TtprC终止子，将这些扩增产物组装成Ptef1-Cas9-TtprC盒，并插入携带bar标记的p0380 bar质粒中，以产生Cas9表达载体p0380-bar-Ptef1-Cas9-TtprC。构建Cas9-eGFP表达载体（p0380-bar-Ptef1-Cas9-eGFP-TtprC），其中增强的GFP（eGFP）作为报告基因与Cas9融合。为了在原生质体中表达sgRNA，使用引物对U6-F/R从ATCC 42464基因组DNA中扩增嗜热分枝杆菌U6启动子，然后使用U6-F和gRNA-R通过融合PCR将其融合到sgRNA支架片段上。将得到的融合片段克隆到pJET1.2/钝性克隆载体中，以产生相应的质粒U6p-sgRNA。
参考文献：Liu Q, Gao R, Li J, Lin L, Zhao J, Sun W, Tian C. Development of a genome-editing CRISPR/Cas9 system in thermophilic fungal Myceliophthora species and its application to hyper-cellulase production strain engineering. Biotechnol Biofuels. 2017 Jan 3;10:1.
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使用引物扩增合成的NLS-Cas9-NLS、强组成型tef1启动子和TtprC终止子，将这些扩增产物组装成Ptef1-Cas9-TtprC盒，并插入携带bar标记的p0380 bar质粒中，以产生Cas9表达载体p0380-bar-Ptef1-Cas9-TtprC。构建Cas9-eGFP表达载体（p0380-bar-Ptef1-Cas9-eGFP-TtprC），其中增强的GFP（eGFP）作为报告基因与Cas9融合。为了在原生质体中表达sgRNA，使用引物对U6-F/R从ATCC 42464基因组DNA中扩增嗜热分枝杆菌U6启动子，然后使用U6-F和gRNA-R通过融合PCR将其融合到sgRNA支架片段上。将得到的融合片段克隆到pJET1.2/钝性克隆载体中，以产生相应的质粒U6p-sgRNA。
参考文献：Liu Q, Gao R, Li J, Lin L, Zhao J, Sun W, Tian C. Development of a genome-editing CRISPR/Cas9 system in thermophilic fungal Myceliophthora species and its application to hyper-cellulase production strain engineering. Biotechnol Biofuels. 2017 Jan 3;10:1.
