为了优化Cas9表达的启动子，构建了质粒pRfp1和pRfp2。分别使用通过PCR从pRed_cas9_recA_Δpoxb300和pEC-XK99E-rfp中扩增出cas9基因的前180 bp和全长rfp基因。在Ptac的控制下，将cas9和rfp基因亚克隆到pXMJ19的HindIII和PstI位点，产生pRfp1。分别使用引物通过PCR扩增PprpD2、cas9180bp、rfp和pXMJ19骨架，并组装成pRfp2。pRfp1和pRfp2分别通过电转化引入谷氨酸棒杆菌SL4。为了构建质粒pCas9，通过PCR扩增cas9基因，并在Ptac的控制下将其插入pXMJ19的HindIII和PstI位点。质粒pgRNA1是通过连接lacIq-Ptac片段、靶向ldhA的gRNA片段和pEC-XK99E产生的。分别使用引物通过PCR从pXMJ19、pRed_Cas9_recA_Δpoxb300和pEC XK99E中扩增出这三个DNA片段。靶向ldhA的Te gRNA包含一个碱基配对区、一个Cas9接口和一个化脓性链球菌终止子。在质粒pgRNA1中，来自pEC-XK99E骨架的rrnB终止子位于Tsp下游185bp处。
参考文献：Liu J, Wang Y, Lu Y, Zheng P, Sun J, Ma Y. Development of a CRISPR/Cas9 genome editing toolbox for Corynebacterium glutamicum. Microb Cell Fact. 2017 Nov 16;16(1):205.
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为了优化Cas9表达的启动子，构建了质粒pRfp1和pRfp2。分别使用通过PCR从pRed_cas9_recA_Δpoxb300和pEC-XK99E-rfp中扩增出cas9基因的前180 bp和全长rfp基因。在Ptac的控制下，将cas9和rfp基因亚克隆到pXMJ19的HindIII和PstI位点，产生pRfp1。分别使用引物通过PCR扩增PprpD2、cas9180bp、rfp和pXMJ19骨架，并组装成pRfp2。pRfp1和pRfp2分别通过电转化引入谷氨酸棒杆菌SL4。为了构建质粒pCas9，通过PCR扩增cas9基因，并在Ptac的控制下将其插入pXMJ19的HindIII和PstI位点。质粒pgRNA1是通过连接lacIq-Ptac片段、靶向ldhA的gRNA片段和pEC-XK99E产生的。分别使用引物通过PCR从pXMJ19、pRed_Cas9_recA_Δpoxb300和pEC XK99E中扩增出这三个DNA片段。靶向ldhA的Te gRNA包含一个碱基配对区、一个Cas9接口和一个化脓性链球菌终止子。在质粒pgRNA1中，来自pEC-XK99E骨架的rrnB终止子位于Tsp下游185bp处。
参考文献：Liu J, Wang Y, Lu Y, Zheng P, Sun J, Ma Y. Development of a CRISPR/Cas9 genome editing toolbox for Corynebacterium glutamicum. Microb Cell Fact. 2017 Nov 16;16(1):205.
