以基因组DNA为模板，用引物aB4-5v10_F和aB1r-5v10_R扩增Aovps10开放阅读框（ORF）上游侧翼1.4kb的区域，通过BP重组反应插入pDONRP4-P1R中，生成5’入门克隆，pg5 v10。用引物分别扩增出该基因上游0.3kb和下游1.4kb的侧翼区域。将两个片段与引物aB2r-v10_F和aB3-v10_R融合，通过BP重组反应插入pDONRP2R-P3中，生成3’入门克隆pg3v10p。将获得的5’和3’入门克隆与中心入门克隆质粒pgEpG结合，与目的载体pDESTR4-R3进行LR重组反应，生成pg v10pG。以pgvaB4-5v10_F为模板，用引物扩增Aovps10的基因断裂片段，并将其导入NSPlD1菌株。
参考文献：Yoon J, Aishan T, Maruyama J, Kitamoto K. Enhanced production and secretion of heterologous proteins by the filamentous fungus Aspergillus oryzae via disruption of vacuolar protein sorting receptor gene Aovps10. Appl Environ Microbiol. 2010 Sep;76(17):5718-27.
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以基因组DNA为模板，用引物aB4-5v10_F和aB1r-5v10_R扩增Aovps10开放阅读框（ORF）上游侧翼1.4kb的区域，通过BP重组反应插入pDONRP4-P1R中，生成5’入门克隆，pg5 v10。用引物分别扩增出该基因上游0.3kb和下游1.4kb的侧翼区域。将两个片段与引物aB2r-v10_F和aB3-v10_R融合，通过BP重组反应插入pDONRP2R-P3中，生成3’入门克隆pg3v10p。将获得的5’和3’入门克隆与中心入门克隆质粒pgEpG结合，与目的载体pDESTR4-R3进行LR重组反应，生成pg v10pG。以pgvaB4-5v10_F为模板，用引物扩增Aovps10的基因断裂片段，并将其导入NSPlD1菌株。
参考文献：Yoon J, Aishan T, Maruyama J, Kitamoto K. Enhanced production and secretion of heterologous proteins by the filamentous fungus Aspergillus oryzae via disruption of vacuolar protein sorting receptor gene Aovps10. Appl Environ Microbiol. 2010 Sep;76(17):5718-27.
