pNZ9530的骨架用oVPL112-oVPL113扩增，从而排除编码NisR和NisK的基因，用oVPL114-oVPL115从pCAS9中扩增出含有tracrRNA、cas9和直接重复序列的序列，通过Gibson组装融合，然后转化到乳杆菌NZ9000。融合所得质粒命名为pVPL3004。为了克隆直接的CRISPR重复序列，首先构建了pNZ8048的衍生物，其中我们用编码四环素抗性的基因替换了编码氯霉素抗性的基因，用分别位于pNZ8048中cm基因上游和下游的oVPL362-oVPL363扩增了pNZ8049的骨架。以pORI19Tet为模板，用oVPL360-oVPL361扩增了tet基因。然后将上面两个PCR产物连接并命名为pVPL3112。分别用oVPL154-oVPL155和oVPL156-oVPL157扩增pJP042的骨架和cm基因，并通过Gibson组装融合得到pVPL3017，接下来，用oVPL309-oVPL310扩增pVPL3112的骨架，并用oVPL320-oVPL321扩增直接CRISPR重复序列，然后进行钝端连接产生了pVPL3115。用BsaI消化pVPL3115，然后进行凝胶纯化。将一对与30 bp lacL靶区相同的互补寡核苷酸（oVPL151-oVPL152）退火，产生与用BsaI消化的pVPL3115互补的双链片段。然后连接得到pCRISPLacL。
参考文献：Oh JH, van Pijkeren JP. CRISPR-Cas9-assisted recombineering in Lactobacillus reuteri. Nucleic Acids Res. 2014;42(17):e131.
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pNZ9530的骨架用oVPL112-oVPL113扩增，从而排除编码NisR和NisK的基因，用oVPL114-oVPL115从pCAS9中扩增出含有tracrRNA、cas9和直接重复序列的序列，通过Gibson组装融合，然后转化到乳杆菌NZ9000。融合所得质粒命名为pVPL3004。为了克隆直接的CRISPR重复序列，首先构建了pNZ8048的衍生物，其中我们用编码四环素抗性的基因替换了编码氯霉素抗性的基因，用分别位于pNZ8048中cm基因上游和下游的oVPL362-oVPL363扩增了pNZ8049的骨架。以pORI19Tet为模板，用oVPL360-oVPL361扩增了tet基因。然后将上面两个PCR产物连接并命名为pVPL3112。分别用oVPL154-oVPL155和oVPL156-oVPL157扩增pJP042的骨架和cm基因，并通过Gibson组装融合得到pVPL3017，接下来，用oVPL309-oVPL310扩增pVPL3112的骨架，并用oVPL320-oVPL321扩增直接CRISPR重复序列，然后进行钝端连接产生了pVPL3115。用BsaI消化pVPL3115，然后进行凝胶纯化。将一对与30 bp lacL靶区相同的互补寡核苷酸（oVPL151-oVPL152）退火，产生与用BsaI消化的pVPL3115互补的双链片段。然后连接得到pCRISPLacL。
参考文献：Oh JH, van Pijkeren JP. CRISPR-Cas9-assisted recombineering in Lactobacillus reuteri. Nucleic Acids Res. 2014;42(17):e131.
