双质粒系统中的pCas由cas9、λ-Red和sgRNA组成，sgRNA带有lacIq-Ptrc启动子，引导pMB1复制pTarget。通过引物扩增化脓性链球菌MGAS5005的cas9序列和天然启动子，然后连接到PstI/XbaI消化的pSU2718得到pCB001。用引物pA006/pA007从pKD46K（21）中扩增出含有卡那霉素抗性基因kanR和温度敏感复制子repA101（Ts）的kanR-repA101片段，用pA008/pA009从pTrc99A中扩增出lacIq基因和Ptrc启动子（lacIq-Ptrc片段），用pA010/pA011从pTarget中扩增出sgRNA-pMB1序列，。通过pA012/pA013从pKD46中扩增出Red重组酶基因，并用XbaI消化。pCas是通过将cas9盒与kanR-repA101的PstI/BglII消化的重叠PCR产物、lacIq-Ptrc片段和XbaI/BglII酶切的Red基因连接而构建的。通过将MluI/XhoI消化的pTrc99A框架与由pIJ778的pA054/pA055扩增的大观霉素抗性基因aadA连接，构建了pTrc99A-spec。pTargetF系列用于靶向单基因修饰，具有靶向N20序列的感兴趣基因位点，是通过反向PCR获得的，修饰的N20序列挂在引物的5=末端，然后进行自连接。
参考文献：Jiang Y, Chen B, Duan C, Sun B, Yang J, Yang S. Multigene editing in the Escherichia coli genome via the CRISPR-Cas9 system. Appl Environ Microbiol. 2015 Apr;81(7):2506-14. doi: 10.1128/AEM.04023-14. Epub 2015 Jan 30. Erratum in: Appl Environ Microbiol. 2016 May 31;82(12):3693.
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双质粒系统中的pCas由cas9、λ-Red和sgRNA组成，sgRNA带有lacIq-Ptrc启动子，引导pMB1复制pTarget。通过引物扩增化脓性链球菌MGAS5005的cas9序列和天然启动子，然后连接到PstI/XbaI消化的pSU2718得到pCB001。用引物pA006/pA007从pKD46K（21）中扩增出含有卡那霉素抗性基因kanR和温度敏感复制子repA101（Ts）的kanR-repA101片段，用pA008/pA009从pTrc99A中扩增出lacIq基因和Ptrc启动子（lacIq-Ptrc片段），用pA010/pA011从pTarget中扩增出sgRNA-pMB1序列，。通过pA012/pA013从pKD46中扩增出Red重组酶基因，并用XbaI消化。pCas是通过将cas9盒与kanR-repA101的PstI/BglII消化的重叠PCR产物、lacIq-Ptrc片段和XbaI/BglII酶切的Red基因连接而构建的。通过将MluI/XhoI消化的pTrc99A框架与由pIJ778的pA054/pA055扩增的大观霉素抗性基因aadA连接，构建了pTrc99A-spec。pTargetF系列用于靶向单基因修饰，具有靶向N20序列的感兴趣基因位点，是通过反向PCR获得的，修饰的N20序列挂在引物的5=末端，然后进行自连接。
参考文献：Jiang Y, Chen B, Duan C, Sun B, Yang J, Yang S. Multigene editing in the Escherichia coli genome via the CRISPR-Cas9 system. Appl Environ Microbiol. 2015 Apr;81(7):2506-14. doi: 10.1128/AEM.04023-14. Epub 2015 Jan 30. Erratum in: Appl Environ Microbiol. 2016 May 31;82(12):3693.
