通过代谢工程的大肠杆菌从甘油中高效生产l-乳酸

以大肠杆菌 B0013 染色体 DNA 为模板，利用 PCR 扩增获得乳酸脱氢酶基因 (ldhA)，将 PCR 产物克隆入pUC19 的 EcoRⅠ 位点中，获得重组质粒pUC-ldhA。用 PstⅠ酶切并与difGm 片段连接，获得重组质粒 pUC-ldhA:: Gmdif。用 EcoRⅠ酶切该重组质粒，获得乳酸脱氢酶的基因删除序列ldhA::Gmdif。将此基因删除序列转化入 E. coli B0013-070。

将 BcoaLDH 基因片段克隆入 pBlueScript SK(-)的 BamHⅠ和 EcoRⅠ位点，获得重组质粒 pSK-BcoaLDH。然后将difGm 片段克隆入重组质粒 pSK-BcoaLDH 的SmaⅠ 位点。获得重组质粒 pSK-BcoaLDHdifGm。以 E. coli CICIM B0013 染色体 DNA 为模板，扩增获得 ldhA 基因的全部启动子和部分结构区片段，并将片段 ldhA克隆入亚克隆载体 pUC19 的 SmaⅠ位点获得重组质粒 pUC-ldhA’。以重组质粒 pUC-ldhA’为模板反向扩增获得线性pUC-ldhA’，并与经 BamHⅠ和 EcoRⅠ酶切获得的 BcoaLDH-difGm 片段连接，获得重组质粒pUC-PldhA-BcoaLDH-difGm。首先通过 PCR 扩增获得 lldD 基因片段，并将该片段克隆入亚克隆载体 pMD18T-simple 的EcoRⅤ位点获得重组质粒 pMD-lldD。然后将PldhA-BcoaLDH-difGm 片段克隆入重组质粒pMD-lldD 的 BamHⅠ和 EcoRⅠ位点。获得重组质粒 pMD-lldD::PldhA-BcoaLDH-difGm。纯化表达突变盒 lldD::PldhA-BcoaLDH-difGm 片段，电击转化其入菌株 B0013-080C。