PCR扩增pACYC184衍生的复制起点，克隆到pGIZ850的NaeI位点得到pNZ7101。为了引入lox66和钝端酶切位点SwaI和PmeI，将连接子退火后克隆到pNZ7101的P32-cat盒上游的Bsp1286I和Tth111I酶切位点，得到pNZ5315。将含有lox71和钝端酶切位点Ecl136II和SrfI的连接子退火后克隆到pNZ5315p32-cat盒下游的PpuMI和PvuI酶切位点，得到pNZ5317。从乳酸乳杆菌MG1363中进行PCR扩增出las操纵子和pepN终止区，将las基因用Ecl136II消化后克隆到用AflIII消化，用Klenow酶处理产生钝端的pNZ5317中。将pepN基因克隆到靶向载体的PvuII酶切位点，得到pNZ5318。通过BbsI和SalI酶切从pNZ5318诱变载体中去除残余和非功能的DNA序列，用Klenow酶处理生成钝端，并自连接，得到pNZ5319。
参考文献：Lambert JM, Bongers RS, Kleerebezem M. Cre-lox-based system for multiple gene deletions and selectable-marker removal in Lactobacillus plantarum. Appl Environ Microbiol. 2007 Feb;73(4):1126-35.
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PCR扩增pACYC184衍生的复制起点，克隆到pGIZ850的NaeI位点得到pNZ7101。为了引入lox66和钝端酶切位点SwaI和PmeI，将连接子退火后克隆到pNZ7101的P32-cat盒上游的Bsp1286I和Tth111I酶切位点，得到pNZ5315。将含有lox71和钝端酶切位点Ecl136II和SrfI的连接子退火后克隆到pNZ5315p32-cat盒下游的PpuMI和PvuI酶切位点，得到pNZ5317。从乳酸乳杆菌MG1363中进行PCR扩增出las操纵子和pepN终止区，将las基因用Ecl136II消化后克隆到用AflIII消化，用Klenow酶处理产生钝端的pNZ5317中。将pepN基因克隆到靶向载体的PvuII酶切位点，得到pNZ5318。通过BbsI和SalI酶切从pNZ5318诱变载体中去除残余和非功能的DNA序列，用Klenow酶处理生成钝端，并自连接，得到pNZ5319。
参考文献：Lambert JM, Bongers RS, Kleerebezem M. Cre-lox-based system for multiple gene deletions and selectable-marker removal in Lactobacillus plantarum. Appl Environ Microbiol. 2007 Feb;73(4):1126-35.
