用引物从水稻基因组DNA为模板，采用PCR扩增kojR。将扩增片段插入酶切后的pISI的AscI/NotI位点合成质粒pISI-kojR，该位点包含来自稻瘟病菌的sodM启动子和glaB终止子。编码木霉属的CBHI基因利用引物从合成基因进行PCR扩增。使用融合HD克隆试剂盒将该片段插入质粒pISI的AscI/NotI位点合成质粒pISI-CBHI。然后以pISI-CBHI为模板，PCR扩增CBHI基因。以基因组DNA为模板，采用PCR扩增svaA启动子和svaA终止子。用试剂盒将这些PCR扩增的DNA片段同时插入pIS1的XbaI和PstI位点合成质粒pISI-svaA-CBHI。通过以里氏木霉cDNA为模板扩增EGI基因片段，使用试剂盒将该片段插入质粒pISI的AscI/ NotI位点合成质粒pISI-EG。以pISI-EG为模板，通过PCR扩增EGI基因。PCR扩增hlyA启动子和hlyA终止子。使用试剂盒将这些PCR扩增的DNA片段同时插入pIS1的XbaI和PstI位点。合成的质粒被命名为pISI-hlyA-EGI。米曲霉角质酶基因，来自米根霉脂肪酶n端区域的28个氨基酸，棘孢曲霉BGL基因各自从米曲霉, pISI-GFP,和pδU-PGAGBGL中扩增，使用试剂盒将这些片段同时插入质粒pISI的AscI/NotI位点。合成的质粒被命名为pISI-BGL。通过PCR将pISI-svaA-CBHI线性化。分别从pISI-hlyA-EGI和pIS1-BGL1中扩增EGI和BGL1表达盒。合成的质粒命名为pISI-CBHI-EGI-BGL1。通过PCR扩增CBHI-、EGI-和BGL1表达盒。通过PCR 从pUSC质粒中扩增sC基因。使用In-Fusion PCR克隆系统将这些扩增的片段融合。所得质粒命名为pISIsC-CBHI-EGI-BGL1。

参考文献：Yamada R, Yoshie T, Wakai S, Asai-Nakashima N, Okazaki F, Ogino C, Hisada H, Tsutsumi H, Hata Y, Kondo A. Aspergillus oryzae-based cell factory for direct kojic acid production from cellulose. Microb Cell Fact. 2014 May 18;13:71.