pKKthrAC1034TBC是以大肠杆菌表达质粒pKK223-3为载体，由tac强启动子控制苏氨酸操纵子编码框thrAC1034TBC的表达，其中thrAC1034T、thrB和thrC基因分别编码苏氨酸合成路径中的3个关键酶天冬氨酸激酶Ⅰ-高丝氨酸脱氢酶Ⅰ双功能酶、高丝氨酸激酶和苏氨酸合酶，thrAC1034T编码的天冬氨酸激酶Ⅰ-高丝氨酸脱氢酶Ⅰ能抗苏氨酸反馈抑制，过量表达thrAC1034TBC，能有效促进苏氨酸的合成。大肠杆菌基因敲除采用λred同源重组技术：以质粒pKD13为模板，用引物扩增含有FRT位点、同源臂和kan基因的目的基因打靶片段。将打靶片段电转入含有质粒pKD46的目的菌株，同源替换目的基因，用卡那霉素平板初步筛选阳性转化子。将辅助质粒pCP20电转入目的基因敲除菌株，消除kan基因，用氯霉素平板初步筛选阳性转化子，引物鉴定筛选kan基因成功消除的菌株，并将PCR产物TA克隆至pMD19-T载体，测序证明目的基因敲除正确。
参考文献：杨冬美, 李华, 李由然, 张梁, 丁重阳, 李赢, 顾正华, 石贵阳. 大肠杆菌TdcC、SstT和LIV-1系统缺失对胞外L-苏氨酸积累的影响[J]. 微生物学通报, 2017, 44(1): 20-29.
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pKKthrAC1034TBC是以大肠杆菌表达质粒pKK223-3为载体，由tac强启动子控制苏氨酸操纵子编码框thrAC1034TBC的表达，其中thrAC1034T、thrB和thrC基因分别编码苏氨酸合成路径中的3个关键酶天冬氨酸激酶Ⅰ-高丝氨酸脱氢酶Ⅰ双功能酶、高丝氨酸激酶和苏氨酸合酶，thrAC1034T编码的天冬氨酸激酶Ⅰ-高丝氨酸脱氢酶Ⅰ能抗苏氨酸反馈抑制，过量表达thrAC1034TBC，能有效促进苏氨酸的合成。大肠杆菌基因敲除采用λred同源重组技术：以质粒pKD13为模板，用引物扩增含有FRT位点、同源臂和kan基因的目的基因打靶片段。将打靶片段电转入含有质粒pKD46的目的菌株，同源替换目的基因，用卡那霉素平板初步筛选阳性转化子。将辅助质粒pCP20电转入目的基因敲除菌株，消除kan基因，用氯霉素平板初步筛选阳性转化子，引物鉴定筛选kan基因成功消除的菌株，并将PCR产物TA克隆至pMD19-T载体，测序证明目的基因敲除正确。
参考文献：杨冬美, 李华, 李由然, 张梁, 丁重阳, 李赢, 顾正华, 石贵阳. 大肠杆菌TdcC、SstT和LIV-1系统缺失对胞外L-苏氨酸积累的影响[J]. 微生物学通报, 2017, 44(1): 20-29.
