重组大肠杆菌全细胞催化L-苏氨酸合成2, 5-二甲基吡嗪

在GenBank数据库中获取乳脂链球菌Lactococcus cremoris MG1363中NADH氧化酶(NoxE)基因序列，根据大肠杆菌密码子偏好性进行优化、合成并连接至表达载体pRSFDuet-tdh的酶切位点EcoRⅠ和Hind Ⅲ间，获得重组质粒pRSFDuet-tdh-noxELc，或者连接至表达载体pRSFDuet-tdh的酶切位点NdeⅠ和XhoⅠ间，获得重组质粒pRSFDuet-tdh-PnoxELc。此外，根据TDH氨基酸序列和NoxE氨基酸序列设计融合蛋白，在两者之间加入(GGGGS)×2作为融合蛋白Linker，将拼接融合蛋白氨基酸序列根据大肠杆菌密码子偏好性进行优化、合成并连接至表达载体pRSFDuet-1的酶切位点BamHⅠ和Hind Ⅲ间，获得重组质粒pRSFDuet-tdh-noxELc。分别将重组质粒pRSFDuet-tdh-noxELc、pRSFDuet- tdh-PnoxELc和pRSFDuet-tdh-noxELc转化至感受态细胞E. coli BL21中，通过Kan抗性筛选，获得重组菌。根据GenBank数据库中的sstT基因序列设计PCR扩增引物，上下游引物分别引入酶切位点NdeⅠ和XhoⅠ，并进行PCR扩增。将纯化后的PCR产物即sstT片段与重组载体pRSFDuet-tdh-noxE分别用限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ进行双酶切，回收目的片段后以T4 DNA连接酶连接。将酶连产物转化至E. coli DH5α感受态细胞，培养后挑取单菌落并提取质粒，获得目标重组质粒pRSFDuet-tdh-noxE-PsstT。使用pKD13作为PCR模板，将引物扩增获得含有目标基因的上游和下游同源臂序列、卡那霉素抗性基因kan和2个FRT位点的DNA片段，随后电转入E. coli/pKD46感受态细胞中。培养后挑使用引物进行菌落PCR扩增，挑选目标基因敲除成功的菌落。