以各菌株基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得相应各菌种基因tdh。对质粒pMA0911进行双酶切，酶切位点为NdeI/EcoR I。PCR扩增产物和与酶切的质粒pMA0911经胶回收纯化后使用In-Fusion HD Cloning Kit进行连接。将连接产物转入E.coli DH5α感受态细胞中，通过氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆子。提取质粒，验证阳性克隆子的正确性，通过基因合成获取重组质粒pMA0911-nox，以此质粒为模板，设计引物nox-F/R，通过PCR扩增获得相应的基因nox。PCR扩增产物和酶切质粒pMA0911-tdh(E.c)经胶回收纯化后使用In-Fusion HD Cloning Kit进行连接(50 ℃，15 min)。将连接产物转入E.coli DH5α感受态细胞，通过氨苄青霉素抗性(100 μg/mL)筛选阳性克隆子，提取质粒，通过酶切和测序验证其正确性。
参考文献：[1]曹艳丽,张丽杰,徐岩.以L-苏氨酸为发酵底物的2,5-二甲基吡嗪高产菌株构建[J].食品与发酵工业, 2020,46(1):10.
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以各菌株基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得相应各菌种基因tdh。对质粒pMA0911进行双酶切，酶切位点为NdeI/EcoR I。PCR扩增产物和与酶切的质粒pMA0911经胶回收纯化后使用In-Fusion HD Cloning Kit进行连接。将连接产物转入E.coli DH5α感受态细胞中，通过氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆子。提取质粒，验证阳性克隆子的正确性，通过基因合成获取重组质粒pMA0911-nox，以此质粒为模板，设计引物nox-F/R，通过PCR扩增获得相应的基因nox。PCR扩增产物和酶切质粒pMA0911-tdh(E.c)经胶回收纯化后使用In-Fusion HD Cloning Kit进行连接(50 ℃，15 min)。将连接产物转入E.coli DH5α感受态细胞，通过氨苄青霉素抗性(100 μg/mL)筛选阳性克隆子，提取质粒，通过酶切和测序验证其正确性。
参考文献：[1]曹艳丽,张丽杰,徐岩.以L-苏氨酸为发酵底物的2,5-二甲基吡嗪高产菌株构建[J].食品与发酵工业, 2020,46(1):10.
