为了释放对thrA基因编码的天冬氨酸激酶I和高丝氨酸脱氢酶I的反馈抑制，以及细胞内苏氨酸对thrABC操纵子的转录衰减，引入了Tac启动子控制下的反馈抗性thrA*BC操纵子，以取代基因组中的野生型thrABC操纵子。通过PCR从大肠杆菌ATCC 21277基因组DNA中扩增出反馈抗性thrA*BC操纵子，从质粒pCSI中扩增出含有氯霉素抗性基因（cat）和I-SceI识别位点的片段。最后，从MDS42和MG1655的染色体DNA中PCR扩增出thrABC操纵子左侧的同源片段。使用引物通过重组PCR将该片段和上述2个PCR片段组合在一起。将构建DNA盒电转化到MDS42中，然后通过在42°C下生长所选重组体来固化辅助质粒pKD46。然后，通过由pST76-ASceP表达的I-SceI内切酶介导的双链断裂修复，从构建的重组菌株中切下如上所述引入的目标基因，为了在Tac启动子的控制下组成性表达反馈抗性thrA*BC操纵子，通过无标记缺失法从基因组中删除lacI基因。为了防止细胞内产生的L-苏氨酸降解，通过无标记缺失法从基因组中删除苏氨酸脱氢酶基因（tdh）。为了进一步增加苏氨酸产量，两个苏氨酸摄取基因tdcC和sstT被突变的苏氨酸输出基因（rhtA23）依次替换。
参考文献：Lee JH, Sung BH, Kim MS, Blattner FR, Yoon BH, Kim JH, Kim SC. Metabolic engineering of a reduced-genome strain of Escherichia coli for L-threonine production. Microb Cell Fact. 2009 Jan 7;8:2.
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为了释放对thrA基因编码的天冬氨酸激酶I和高丝氨酸脱氢酶I的反馈抑制，以及细胞内苏氨酸对thrABC操纵子的转录衰减，引入了Tac启动子控制下的反馈抗性thrA*BC操纵子，以取代基因组中的野生型thrABC操纵子。通过PCR从大肠杆菌ATCC 21277基因组DNA中扩增出反馈抗性thrA*BC操纵子，从质粒pCSI中扩增出含有氯霉素抗性基因（cat）和I-SceI识别位点的片段。最后，从MDS42和MG1655的染色体DNA中PCR扩增出thrABC操纵子左侧的同源片段。使用引物通过重组PCR将该片段和上述2个PCR片段组合在一起。将构建DNA盒电转化到MDS42中，然后通过在42°C下生长所选重组体来固化辅助质粒pKD46。然后，通过由pST76-ASceP表达的I-SceI内切酶介导的双链断裂修复，从构建的重组菌株中切下如上所述引入的目标基因，为了在Tac启动子的控制下组成性表达反馈抗性thrA*BC操纵子，通过无标记缺失法从基因组中删除lacI基因。为了防止细胞内产生的L-苏氨酸降解，通过无标记缺失法从基因组中删除苏氨酸脱氢酶基因（tdh）。为了进一步增加苏氨酸产量，两个苏氨酸摄取基因tdcC和sstT被突变的苏氨酸输出基因（rhtA23）依次替换。
参考文献：Lee JH, Sung BH, Kim MS, Blattner FR, Yoon BH, Kim JH, Kim SC. Metabolic engineering of a reduced-genome strain of Escherichia coli for L-threonine production. Microb Cell Fact. 2009 Jan 7;8:2.
