| 1. 慢病毒（Lentivirus）之所以称之为慢病毒，是因为感染者主要临床特点是在出现典型的临床症状以前，经历较长的潜伏期，之后缓慢发病。 2. 慢病毒是逆转录病毒的一种，它能够将靶基因导入到一些较难转染的细胞中，甚至是原代细胞等，并且将靶基因随机整合到宿主的基因组中，从而大大增加了转染效率，并且能够在细胞系中稳定表达若干代，可以进行稳转细胞株的筛选。 3. 慢病毒包装的优点： ① 能将外源基因有效整合入宿主染色体，外源基因表达水平较高、表达稳定； ② 广泛的宿主，可感染分裂和不分裂的细胞，几乎可以感染所有类型的细胞，特别适合质粒载体转染效率低的细胞； ③ 适用范围广，可用于体外细胞系和活体动物模型，研究基因和RNAi等； ④ 转导效率高，目的基因整合到宿主细胞基因组的概率大大增加。 实验步骤（以293T细胞为例）： 细胞准备：复苏后的293T细胞传1代后，用胰酶消化法将对数期的细胞铺于75cm2的培养瓶，放入37℃，5%CO2培养箱进行培养，待细胞密度达到60-80%方可转染。 转染：待细胞达到转染密度（一般24小时左右），制备转染复合体。取1个灭菌过的EP管，加入 1 mL OPTI-MEM 培养液，随后分别将9μg目的质粒、6μg 的pSPAX2、3μg的 pMD2.G（比例3:2:1，注意单位是μg，需要换算为μL）加入以上EP管，混匀，再加入54 μL 转染试剂 Omifection，混合 10 次，室温静置30min后将其加入293T细胞中放回培养箱。 注：若没有pSPAX2和pMD2.G质粒，可以使用Lenti-Mix。 换液：转染6-12 h，将上清弃于有消毒液的废液瓶里，加入15mL的新鲜细胞培养液继续培养。 收集病毒上清：转染 48 h，将细胞上清收集到50mL离心管，4℃保存。随后加入15mL新鲜细胞培养液于细胞培养瓶里放回培养箱，24h后收集上清于以上50mL离心管（两次收的上清也可以装在不同离心管里分别纯化、测滴度后进行使用），4℃，5000rpm，离心10min，上清液转移到新离心管后4 ℃保存不超过1 个月，长期保存于-80 ℃冰箱。 注意事项： 293T细胞的代数最好用15代以内，最多不超过20代，否则影响转染效率。 质粒浓度在400-1000ng/μL范围，纯度260/280在1.8-2.0之间的转染效率较高。 混合体轻轻滴入细胞上清后摇匀，动作要轻，293T细胞贴壁不牢避免细胞脱落。 为了提高纯度，建议使用慢病毒纯化试剂盒。纯化前后效果有明显的差异，步骤与结果如下： 慢病毒纯化：按试剂盒配置好含有慢病毒上清液的混合体后， 4 ℃旋转混合 60 min。 磁珠收集：孵育完毕，将离心管放入离心机，5000rpm， 4 ℃离心 5 min，沉淀磁珠，弃上清 去除残余液体：将装有磁珠沉淀的离心管转入离心机， 5000 rpm， 4 ℃离心2 min，吸走残余液体。 洗脱：加入 1 ml PBS 或 ddH2O， 剧烈震荡（Vortex） 1 min。8,000 rpm，4 ℃离心 2 min，立即将上清转移至新的无菌 EP 管中，即为纯化的慢病毒溶液。 过滤：利用试剂盒提供的针式过滤器，过滤纯化的慢病毒溶液，除去杂质。 纯化的慢病毒可立即进行滴度测定或感染目的细胞，也可保存于 4 ℃（1个月内用完）或-80℃（长期，避免反复冻融。每冻融一次，病毒感染效果降低 30-50%。 滴度测定：用慢病毒滴度检测卡测定慢病毒滴度。 |
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