利用引物从pAN7-1中扩增出潮霉素磷酸化转移酶（hph）盒。用引物从p414-TEF1p-Cas9-CYC1t中扩增出Ptef1-cas9盒。
从p426-SNR52pgRNA.CAN1.Y-SUP4t中扩增出SNR52启动子；从p426-SNR52p-gRNA.CAN1.YSUP4t中扩增出pksP-gRNA；利用引物将SNR52启动子和pksPgRNA片段进行重叠PCR融合，将hph、cas9和pksP-gRNA片段组装起来，并在酿酒酵母细胞内通过同源重组克隆到pRS426中，纯化得到phph-Ptef1-cas9-pksP-gRNA。将纯化后的质粒作为引物1和8的PCR模板，将hph-cas9-gRNA产物导入Af293原生质体。使用引物从pBC-phleo中扩增出bleR盒。用引物从p426-SNR52p-gRNA.CAN1.Y-SUP4t中扩增出SNR52启动子，利用引从p426-SNR52pgRNA.CAN1.Y-SUP4t中扩增出pksP-gRNA，使用引物将SNR52启动子和pksP-gRNA片段进行重叠PCA融合。利用引物将bleR和pksP-gRNA片段进行重叠PCR融合，并将重叠产物克隆到pSC-amp/kan中。将p-bleR-pksP-gRNA质粒用KpnI限制性内切酶线性化，通过化学转化将其引入Af293或CEA10 cas9-hph菌株中。用引物扩增hph盒。用引物从p426-SNR52p-gRNA.CAN1.Y-SUP4t中扩增出SNR52启动子， 使用引物从p426-SNR52pgRNA.CAN1.Y-SUP4t中扩增出pksP-gRNA，使用引物将SNR52启动子和pksP-gRNA片段进行重叠PCA融合。最后，将hph和pksP-gRNA片段组装起来，并在酿酒酵母细胞内进行同源重组，克隆到pRS426中。将得到的p-hph-pksP-gRNA质粒作为引物的PCR模板。
参考文献：Fuller KK, Chen S, Loros JJ, Dunlap JC. Development of the CRISPR/Cas9 System for Targeted Gene Disruption in Aspergillus fumigatus. Eukaryot Cell. 2015 Nov;14(11):1073-80.
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从p426-SNR52pgRNA.CAN1.Y-SUP4t中扩增出SNR52启动子；从p426-SNR52p-gRNA.CAN1.YSUP4t中扩增出pksP-gRNA；利用引物将SNR52启动子和pksPgRNA片段进行重叠PCR融合，将hph、cas9和pksP-gRNA片段组装起来，并在酿酒酵母细胞内通过同源重组克隆到pRS426中，纯化得到phph-Ptef1-cas9-pksP-gRNA。将纯化后的质粒作为引物1和8的PCR模板，将hph-cas9-gRNA产物导入Af293原生质体。使用引物从pBC-phleo中扩增出bleR盒。用引物从p426-SNR52p-gRNA.CAN1.Y-SUP4t中扩增出SNR52启动子，利用引从p426-SNR52pgRNA.CAN1.Y-SUP4t中扩增出pksP-gRNA，使用引物将SNR52启动子和pksP-gRNA片段进行重叠PCA融合。利用引物将bleR和pksP-gRNA片段进行重叠PCR融合，并将重叠产物克隆到pSC-amp/kan中。将p-bleR-pksP-gRNA质粒用KpnI限制性内切酶线性化，通过化学转化将其引入Af293或CEA10 cas9-hph菌株中。用引物扩增hph盒。用引物从p426-SNR52p-gRNA.CAN1.Y-SUP4t中扩增出SNR52启动子， 使用引物从p426-SNR52pgRNA.CAN1.Y-SUP4t中扩增出pksP-gRNA，使用引物将SNR52启动子和pksP-gRNA片段进行重叠PCA融合。最后，将hph和pksP-gRNA片段组装起来，并在酿酒酵母细胞内进行同源重组，克隆到pRS426中。将得到的p-hph-pksP-gRNA质粒作为引物的PCR模板。
参考文献：Fuller KK, Chen S, Loros JJ, Dunlap JC. Development of the CRISPR/Cas9 System for Targeted Gene Disruption in Aspergillus fumigatus. Eukaryot Cell. 2015 Nov;14(11):1073-80.
