cbh1启动子及其突变片段用SpeI和XbaI双重消化，并连接到质粒pDHt/sk的SpeI/XbaI位点，获得载体pDHt/sk-pcbh1、pDHt/ska-pcbh1m1、pDHd/sk-pcbh1m2。然后用引物GFPF和GFPR进行PCR后，将报告基因egfp引入所有四个载体的XbaI位，构建egfp表达载体。使用重叠的前体cbh1GR和cbh1HR，通过柔性中性聚甘氨酸接4和刚性a-螺旋接4将e1的催化结构域片段与完整的cbh1编码区融合。生成的片段分别命名为tce1-fle和tce1-rig。利用引物cbh1F和E1R将e1的催化结构域与cbh1的信号序列融合，命名为se1h。将6×His标签编码区引入所有片段的3'的。e1与他的标签融合在一起，被命名为e1h。在质粒pDHt/sk-pcbhm2的XbaI位点连接后，构建了含有tce1-fle、tce1-rig、se1和e1h的异源表达载体。cbh1片段也连接到相同的载体中用于转化控制。使用农杆菌介导的真菌转化将异源基因的所有表达载体转化到受体里氏木霉RC30-8中。
参考文献：Zou G, Shi S, Jiang Y, van den Brink J, de Vries RP, Chen L, Zhang J, Ma L, Wang C, Zhou Z. Construction of a cellulase hyper-expression system in Trichoderma reesei by promoter and enzyme engineering. Microb Cell Fact. 2012 Feb 8;11:21.
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cbh1启动子及其突变片段用SpeI和XbaI双重消化，并连接到质粒pDHt/sk的SpeI/XbaI位点，获得载体pDHt/sk-pcbh1、pDHt/ska-pcbh1m1、pDHd/sk-pcbh1m2。然后用引物GFPF和GFPR进行PCR后，将报告基因egfp引入所有四个载体的XbaI位，构建egfp表达载体。使用重叠的前体cbh1GR和cbh1HR，通过柔性中性聚甘氨酸接4和刚性a-螺旋接4将e1的催化结构域片段与完整的cbh1编码区融合。生成的片段分别命名为tce1-fle和tce1-rig。利用引物cbh1F和E1R将e1的催化结构域与cbh1的信号序列融合，命名为se1h。将6×His标签编码区引入所有片段的3'的。e1与他的标签融合在一起，被命名为e1h。在质粒pDHt/sk-pcbhm2的XbaI位点连接后，构建了含有tce1-fle、tce1-rig、se1和e1h的异源表达载体。cbh1片段也连接到相同的载体中用于转化控制。使用农杆菌介导的真菌转化将异源基因的所有表达载体转化到受体里氏木霉RC30-8中。
参考文献：Zou G, Shi S, Jiang Y, van den Brink J, de Vries RP, Chen L, Zhang J, Ma L, Wang C, Zhou Z. Construction of a cellulase hyper-expression system in Trichoderma reesei by promoter and enzyme engineering. Microb Cell Fact. 2012 Feb 8;11:21.
