为了拯救clr-5，从粗糙猪笼草基因组DNA中扩增上游区域和全长NCU05383序列，并使用Gibson试剂盒将其连接到用BglII和BamHI消化的质粒pAN52-bar中，形成构建质粒pAN52-1CP-clr5。将互补质粒线性化并转化到N.crassaΔclr-5中，通过选择对草膦素的抗性来筛选转化型。为了过表达clr-5，将粗糙猪笼草强组成型tef1启动子控制下的clr-5 ORF区域插入质粒pAN52-bar的BglII和BamHI位点之间，产生质粒pAN52-OE-clr-5。将构建的线性化重组质粒分别转化到菌株Δclr-5中，通过选择对草膦素的抗性来筛选转化型。
使用引物从质粒p0380-bar-Ptef1-Cas9-TtprC中扩增出表达Cas9的盒。基通过连接U6启动子、基因靶位点和gRNA构建sgRNA。从嗜热分枝杆菌基因组DNA中分别扩增Mtclr-5的5’和3’端片段。将得到的PCR片段以及来自质粒p0380-neo 的选择性标记盒PtrpC-neo组装并插入到使用Gibson组装克隆试剂盒经XbaI/EcoRV消化的pPK2BarGFP质粒中，以产生供体DNA序列供体-Mtclr-5-neo。从粗糙芽孢杆菌基因组DNA中扩增出clr-5的开放阅读框，并使用Gibson试剂盒将其克隆到质粒pAN52-bar中，在Mtclr-5的天然启动子的控制下，形成互补质粒pAN52-CP-Ncclr-5。为了在嗜热毛壳菌中构建过表达粗糙脉孢霉clr-5的质粒，将粗糙芽孢杆菌clr-5的片段和MtgpdA的强组成型启动子组装并插入到使用吉布森组装克隆试剂盒的BglII/BamHI消化的质粒pAN52-bar中，以产生载体pAN52-OE-Ncclr-5。
参考文献：Xue F, Zhao Z, Gu S, Chen M, Xu J, Luo X, Li J, Tian C. The transcriptional factor Clr-5 is involved in cellulose degradation through regulation of amino acid metabolism in Neurospora crassa. BMC Biotechnol. 2023 Nov 29;23(1):50.
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为了拯救clr-5，从粗糙猪笼草基因组DNA中扩增上游区域和全长NCU05383序列，并使用Gibson试剂盒将其连接到用BglII和BamHI消化的质粒pAN52-bar中，形成构建质粒pAN52-1CP-clr5。将互补质粒线性化并转化到N.crassaΔclr-5中，通过选择对草膦素的抗性来筛选转化型。为了过表达clr-5，将粗糙猪笼草强组成型tef1启动子控制下的clr-5 ORF区域插入质粒pAN52-bar的BglII和BamHI位点之间，产生质粒pAN52-OE-clr-5。将构建的线性化重组质粒分别转化到菌株Δclr-5中，通过选择对草膦素的抗性来筛选转化型。
使用引物从质粒p0380-bar-Ptef1-Cas9-TtprC中扩增出表达Cas9的盒。基通过连接U6启动子、基因靶位点和gRNA构建sgRNA。从嗜热分枝杆菌基因组DNA中分别扩增Mtclr-5的5’和3’端片段。将得到的PCR片段以及来自质粒p0380-neo 的选择性标记盒PtrpC-neo组装并插入到使用Gibson组装克隆试剂盒经XbaI/EcoRV消化的pPK2BarGFP质粒中，以产生供体DNA序列供体-Mtclr-5-neo。从粗糙芽孢杆菌基因组DNA中扩增出clr-5的开放阅读框，并使用Gibson试剂盒将其克隆到质粒pAN52-bar中，在Mtclr-5的天然启动子的控制下，形成互补质粒pAN52-CP-Ncclr-5。为了在嗜热毛壳菌中构建过表达粗糙脉孢霉clr-5的质粒，将粗糙芽孢杆菌clr-5的片段和MtgpdA的强组成型启动子组装并插入到使用吉布森组装克隆试剂盒的BglII/BamHI消化的质粒pAN52-bar中，以产生载体pAN52-OE-Ncclr-5。
参考文献：Xue F, Zhao Z, Gu S, Chen M, Xu J, Luo X, Li J, Tian C. The transcriptional factor Clr-5 is involved in cellulose degradation through regulation of amino acid metabolism in Neurospora crassa. BMC Biotechnol. 2023 Nov 29;23(1):50.
