使用NEB Gibson组装试剂盒将UGI，Ptef1启动子（8）和TtrpC终止子扩增并组装到p0380-bar质粒（69）中，以形成evo-BE4max，GAM-BE4max和evo-CDA1编辑器。先前构建了Cas9表达PCR盒bar-Ptef1-Cas9-TtprC，以及选择标记neo和bar。为了选择靶向AMD，cre-1和Mtclr-2的特定sgRNA，使用sgRNACas9工具鉴定嗜热支原体基因组中的所有sgRNA靶位点，并选择高分的sgRNA靶位点。通过引物重叠PCR产生靶向嗜热分枝杆菌U6启动子驱动的sgRNA，并将其克隆到pJET1.2/blunt克隆载体中，该载体产生相应的质粒U6p-amdS sgRNA，U6p-cre-1-sgRNA和U6p-Mtclr-2-sgRNA。为了构建基因缺失底物，从p0380-neo质粒中扩增了PtrpC-neo盒。通过使用配对引物的PCR，从嗜热支原体基因组DNA中分别扩增出Mtclr-2的5’和3’个侧翼片段。使用NEB Gibson assem bly试剂盒将扩增的5’、3’和PtrpC-neo片段组装并连接到pJET1.2/blunt克隆载体中，以产生供体-clr-2 DNA序列。
参考文献：Zhang C, Li N, Rao L, Li J, Liu Q, Tian C. Development of an Efficient C-to-T Base-Editing System and Its Application to Cellulase Transcription Factor Precise Engineering in Thermophilic Fungus Myceliophthora thermophila. Microbiol Spectr. 2022 Jun 29;10(3):e0232121.
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使用NEB Gibson组装试剂盒将UGI，Ptef1启动子（8）和TtrpC终止子扩增并组装到p0380-bar质粒（69）中，以形成evo-BE4max，GAM-BE4max和evo-CDA1编辑器。先前构建了Cas9表达PCR盒bar-Ptef1-Cas9-TtprC，以及选择标记neo和bar。为了选择靶向AMD，cre-1和Mtclr-2的特定sgRNA，使用sgRNACas9工具鉴定嗜热支原体基因组中的所有sgRNA靶位点，并选择高分的sgRNA靶位点。通过引物重叠PCR产生靶向嗜热分枝杆菌U6启动子驱动的sgRNA，并将其克隆到pJET1.2/blunt克隆载体中，该载体产生相应的质粒U6p-amdS sgRNA，U6p-cre-1-sgRNA和U6p-Mtclr-2-sgRNA。为了构建基因缺失底物，从p0380-neo质粒中扩增了PtrpC-neo盒。通过使用配对引物的PCR，从嗜热支原体基因组DNA中分别扩增出Mtclr-2的5’和3’个侧翼片段。使用NEB Gibson assem bly试剂盒将扩增的5’、3’和PtrpC-neo片段组装并连接到pJET1.2/blunt克隆载体中，以产生供体-clr-2 DNA序列。
参考文献：Zhang C, Li N, Rao L, Li J, Liu Q, Tian C. Development of an Efficient C-to-T Base-Editing System and Its Application to Cellulase Transcription Factor Precise Engineering in Thermophilic Fungus Myceliophthora thermophila. Microbiol Spectr. 2022 Jun 29;10(3):e0232121.
