对化脓性链球菌cas9的编码序列进行了翻译密码子优化。将编码核定位信号（NLS）肽的核苷酸序列融合到cas9的羧基端。Cas9-NLS的DNA序列由IDT Inc.合成，用引物Cas9-F和Cas9-R扩增，分别在5‘和3’端添加PacI和FseI酶切位点。用PacI和FseI的限制性内切酶片段，在表达载体ANEp8中克隆pkiA启动子下游的cas9-NLS。将得到的含cas9的质粒命名为ANEp8-Cas9。通过PCR扩增将以SwaI限制性位点为中心的38 bp不依赖连接的克隆位点引入ANEp8-Cas9质粒中。通过使用LIC方法，将所得质粒用作宿主载体以携带gRNA盒。用一对末端引物扩增用于质粒构建的gRNA盒，以与两侧的LIC序列位点连接，以在ANEp8-Cas9载体和gRNA盒插入物之间产生互补的单链突出端。在dGTP和dCTP存在下，分别用T4 DNA聚合酶处理线性化的ANEp8-Cas9和gRNA盒DNA。
参考文献：Song L, Ouedraogo JP, Kolbusz M, Nguyen TTM, Tsang A. Efficient genome editing using tRNA promoter-driven CRISPR/Cas9 gRNA in Aspergillus niger. PLoS One. 2018 Aug 24;13(8):e0202868.
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对化脓性链球菌cas9的编码序列进行了翻译密码子优化。将编码核定位信号（NLS）肽的核苷酸序列融合到cas9的羧基端。Cas9-NLS的DNA序列由IDT Inc.合成，用引物Cas9-F和Cas9-R扩增，分别在5‘和3’端添加PacI和FseI酶切位点。用PacI和FseI的限制性内切酶片段，在表达载体ANEp8中克隆pkiA启动子下游的cas9-NLS。将得到的含cas9的质粒命名为ANEp8-Cas9。通过PCR扩增将以SwaI限制性位点为中心的38 bp不依赖连接的克隆位点引入ANEp8-Cas9质粒中。通过使用LIC方法，将所得质粒用作宿主载体以携带gRNA盒。用一对末端引物扩增用于质粒构建的gRNA盒，以与两侧的LIC序列位点连接，以在ANEp8-Cas9载体和gRNA盒插入物之间产生互补的单链突出端。在dGTP和dCTP存在下，分别用T4 DNA聚合酶处理线性化的ANEp8-Cas9和gRNA盒DNA。
参考文献：Song L, Ouedraogo JP, Kolbusz M, Nguyen TTM, Tsang A. Efficient genome editing using tRNA promoter-driven CRISPR/Cas9 gRNA in Aspergillus niger. PLoS One. 2018 Aug 24;13(8):e0202868.
