基因lp\u 0642，lp\u 0641和lp\u 0640分别编码核酸外切酶analogue，单链退火蛋白和潜在的宿主核酸酶抑制剂，从植物乳杆菌WCFS1的原噬菌体P1基因座中鉴定。含有这三个基因的质粒pLP gba首先被转化到细胞中，以介导异源dsDNA底物与宿主基因组DNA之间的有效同源重组。在这里，我们使用CRISPR/Cas9系统在编辑位点诱导双链断裂，并消除抗生素标记和loxP/Cre以外的未编辑细胞。采用人工设计的嵌合单指导RNA代替复杂且不方便的反式激活CRISPR RNA和CRISPR RNA双链体。敲除了nagB基因的631 bp DNA片段。设计了一个dsDNA，命名为dsDNA-ΔnagB。在该nagB敲除片段中选择了原型间隔区相邻基序（PAM）位点。从该PAM设计了sgRNA。在启动子诱导的sppA（pSPA）和内源性组成型启动子3a的控制下，将cas9和设计的sgRNA序列分别克隆到质粒pSIP403中，形成pSIP-C9。作为修饰，将硫代磷酸酯键添加到dsDNA的5=末端，以防止细胞内核酸外切酶的切割。
参考文献：Zhou D, Jiang Z, Pang Q, Zhu Y, Wang Q, Qi Q. CRISPR/Cas9-Assisted Seamless Genome Editing in Lactobacillus plantarum and Its Application in N-Acetylglucosamine Production. Appl Environ Microbiol. 2019 Oct 16;85(21):e01367-19.
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基因lp\u 0642，lp\u 0641和lp\u 0640分别编码核酸外切酶analogue，单链退火蛋白和潜在的宿主核酸酶抑制剂，从植物乳杆菌WCFS1的原噬菌体P1基因座中鉴定。含有这三个基因的质粒pLP gba首先被转化到细胞中，以介导异源dsDNA底物与宿主基因组DNA之间的有效同源重组。在这里，我们使用CRISPR/Cas9系统在编辑位点诱导双链断裂，并消除抗生素标记和loxP/Cre以外的未编辑细胞。采用人工设计的嵌合单指导RNA代替复杂且不方便的反式激活CRISPR RNA和CRISPR RNA双链体。敲除了nagB基因的631 bp DNA片段。设计了一个dsDNA，命名为dsDNA-ΔnagB。在该nagB敲除片段中选择了原型间隔区相邻基序（PAM）位点。从该PAM设计了sgRNA。在启动子诱导的sppA（pSPA）和内源性组成型启动子3a的控制下，将cas9和设计的sgRNA序列分别克隆到质粒pSIP403中，形成pSIP-C9。作为修饰，将硫代磷酸酯键添加到dsDNA的5=末端，以防止细胞内核酸外切酶的切割。
参考文献：Zhou D, Jiang Z, Pang Q, Zhu Y, Wang Q, Qi Q. CRISPR/Cas9-Assisted Seamless Genome Editing in Lactobacillus plantarum and Its Application in N-Acetylglucosamine Production. Appl Environ Microbiol. 2019 Oct 16;85(21):e01367-19.
