起始质粒pBC-hygro是具有CmR抗性基因的基于pBluescript II SK（+）的载体。以缺失BssHII位点的pBC-hygro衍生的质粒pBC为骨架构建二元表达载体。分别用引物对米曲霉α-淀粉酶基因的强启动子和终止子进行PCR扩增。分别使用引物对产生具有α-淀粉酶（amyB）融合蛋白的gfp和PcAmy进行PCR扩增。在反应中使用米曲霉RIB40的基因组DNA作为模板。将用XhoI消化的PamyB和用NotI消化的TamyB的PCR产物以正确的方向插入质粒pBC的XhoI/NotI位点以产生质粒pAsO。用引物从pANE中PCR扩增出构巢曲霉pyrG基因座，该引物包含5'和3'pyrG序列，两侧是40 bp的mate1元件和NdeI限制性酶切位点。用NdeI消化载体pAsO以删除冗余序列，并将线性载体去磷酸化并连接至NdeI消化的PCR-pyrG产物。
参考文献：Yin Y, Mao Y, Yin X, Gao B, Wei D. Construction of a Shuttle Vector for Heterologous Expression of a Novel Fungal α-Amylase Gene in Aspergillus oryzae. J Microbiol Biotechnol. 2015 Jul;25(7):988-98.
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起始质粒pBC-hygro是具有CmR抗性基因的基于pBluescript II SK（+）的载体。以缺失BssHII位点的pBC-hygro衍生的质粒pBC为骨架构建二元表达载体。分别用引物对米曲霉α-淀粉酶基因的强启动子和终止子进行PCR扩增。分别使用引物对产生具有α-淀粉酶（amyB）融合蛋白的gfp和PcAmy进行PCR扩增。在反应中使用米曲霉RIB40的基因组DNA作为模板。将用XhoI消化的PamyB和用NotI消化的TamyB的PCR产物以正确的方向插入质粒pBC的XhoI/NotI位点以产生质粒pAsO。用引物从pANE中PCR扩增出构巢曲霉pyrG基因座，该引物包含5'和3'pyrG序列，两侧是40 bp的mate1元件和NdeI限制性酶切位点。用NdeI消化载体pAsO以删除冗余序列，并将线性载体去磷酸化并连接至NdeI消化的PCR-pyrG产物。
参考文献：Yin Y, Mao Y, Yin X, Gao B, Wei D. Construction of a Shuttle Vector for Heterologous Expression of a Novel Fungal α-Amylase Gene in Aspergillus oryzae. J Microbiol Biotechnol. 2015 Jul;25(7):988-98.
