首先使用引物pCN_AMP_mut_F和pCN_AMP_mut_R的定点诱变消除pCN50的BSAI限制性位点，以产生载体pCN50-BSAI。重组酶在组成型P23启动子的控制下合成为gBlocks，并针对金黄色葡萄球菌进行密码子优化。gBlocks用XmaI和NarI消化，并克隆到类似消化的pCN50-BSAI中，得到载体pCN50-EF2132、pCN50-gp20、pCN50-2recTS2、pCN50-recTS3和pCN50-bet。为了产生载体pCN-EF2132tet，在P23启动子的控制下合成金黄色葡萄球菌密码子优化的tetR盒作为gBlock，然后用引物扩增，Gibson组装到XhoI消化的pCN50-EF2132中。为了构建载体pCAS9counter，通过使用引物从载体pCN33扩增ermC，并克隆到ApaI和XhoI-pCN50-BSAI限制性位点，将pCN50-BSSI的氯霉素抗性盒替换为红霉素抗性盒，以产生质粒pCN50-BS1I-emrc。用引物扩增pCL52.2和pCN50-BSAI-emc，用gibson将产物组装成载体pCN50-ermc E194ts，用引物进行定点突变，在pCAS9中的Cas9末端引入最小SsrA标签，然后从载体pCAS9扩增Cas9，使用引物将其置于PRAB17启动子的控制下，然后克隆到用XmaI和SbfI消化的pCN50-ermc-E194ts中，得到pCN50-termc-Cas9。在PRAB17启动子和下游转录终止子的控制下合成的sgRNA被合成为gBlock，并克隆到pCN50-ermc-Cas9的NarI位点，以产生载体pCAS9counter。
参考文献：Penewit K, Holmes EA, McLean K, Ren M, Waalkes A, Salipante SJ. Efficient and Scalable Precision Genome Editing in Staphylococcus aureus through Conditional Recombineering and CRISPR/Cas9-Mediated Counterselection. mBio. 2018 Feb 20;9(1):e00067-18.
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参考文献：Penewit K, Holmes EA, McLean K, Ren M, Waalkes A, Salipante SJ. Efficient and Scalable Precision Genome Editing in Staphylococcus aureus through Conditional Recombineering and CRISPR/Cas9-Mediated Counterselection. mBio. 2018 Feb 20;9(1):e00067-18.
