使用引物TT16和CAH537从Addgene质粒中扩增Cas9开放阅读框，并通过Gibson组装克隆到pCAH01SpR中。通过IDT合成含有与靶DNA和编辑盒上的PAM位点相邻的20-mer的单个gRNA，并通过Gibson组装克隆到pBBR1MCS-5载体中。pQCH是通过用pAWP78的kan2基因座替换RSF1010中包含sulfR、smrA和smrB基因的3312 bp区域而构建的。构建了一个载体（pgRNA-GFPBFP），该载体具有靶向GFP的gRNA和含有GFP点突变的1-kb DNA修复模板，其引入错义密码子取代T64S和Y65H以将GFP转化为BFP，同时消除Cas9 PAM位点
参考文献：Tapscott T, Guarnieri MT, Henard CA. Development of a CRISPR/Cas9 System for Methylococcus capsulatus In Vivo Gene Editing. Appl Environ Microbiol. 2019 May 16;85(11):e00340-19.
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使用引物TT16和CAH537从Addgene质粒中扩增Cas9开放阅读框，并通过Gibson组装克隆到pCAH01SpR中。通过IDT合成含有与靶DNA和编辑盒上的PAM位点相邻的20-mer的单个gRNA，并通过Gibson组装克隆到pBBR1MCS-5载体中。pQCH是通过用pAWP78的kan2基因座替换RSF1010中包含sulfR、smrA和smrB基因的3312 bp区域而构建的。构建了一个载体（pgRNA-GFPBFP），该载体具有靶向GFP的gRNA和含有GFP点突变的1-kb DNA修复模板，其引入错义密码子取代T64S和Y65H以将GFP转化为BFP，同时消除Cas9 PAM位点
参考文献：Tapscott T, Guarnieri MT, Henard CA. Development of a CRISPR/Cas9 System for Methylococcus capsulatus In Vivo Gene Editing. Appl Environ Microbiol. 2019 May 16;85(11):e00340-19.
