将来自pKE112-davAB的davAB基因进行限制性消化，并连接到pKCA212-MCS中构建pKCA212davAB。用EcoRV/EcoRI限制性消化从pEKEx1去除tac启动子和LacIQ基因编码序列的初始778 bp，创建了无启动子的pEKEx1。使用引物PCR从谷氨酸棒杆菌ATCC 13032染色体扩增超氧化物歧化酶基因起始密码子上游250 bp的区域，然后消化并克隆到无启动子pEKEx1载体的EcoRV/EcoRI位点，构建pJS57。通过克隆davAB基因，从pEKEx1构建质粒p36davAB2。通过PCR扩增PH36启动子，并用EcoRV/EcoRI限制性消化片段。使用引物进行第二轮PCR，产生davAB基因片段，用EcoRI/PstI限制性消化。然后将所得产物连接到无启动子pEKEx1载体的EcoRV/PstI限制位点，得到p36davaAB2。通过克隆davAB基因，从pCES208构建质粒p36davaAB1。使用引物的第一轮PCR产物用于扩增davA基因，然后用BamHI/SfiI进行限制性酶切。第二轮PCR扩增davB基因，然后用NotI进行限制性酶切。通过替换egfp基因将这些片段克隆到pCES208H36GFP载体中，得到p36davaAB1。扩增密码子优化的davA基因，并用BamHI和SfiI进行限制性酶切。扩增密码子优化的davB基因，并用NotI进行限制性酶切。然后通过替换egfp基因将这两种产物克隆到pCES208H36EGFP载体中，构建p36davaAB3。PCR扩增谷氨酸棒杆菌gabT基因的上游区域和一部分，对谷氨酸棒杆菌的下游区域和gabT基因的一部分进行PCR扩增。使用引物通过第三次PCR将两个PCR产物连接起来。将最终的PCR产物克隆到PstI消化的pK19mobsacB中，以制备pJS113β。随后使用pJS113β来破坏谷氨酸棒杆菌BE染色体中的gabT基因，从而产生谷氨酸棒杆菌AVA2菌株。

参考文献：Shin JH, Park SH, Oh YH, Choi JW, Lee MH, Cho JS, Jeong KJ, Joo JC, Yu J, Park SJ, Lee SY. Metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum for enhanced production of 5-aminovaleric acid. Microb Cell Fact. 2016 Oct 7;15(1):174.