用Primer Premier 5（Primer 5）来设计，主要参考了Takara的试剂盒说明书上对于引物设计的要求（如图）。
其他就是普通PCR引物的要求了，而这些只要看引物设计软件的评分就可以了，评分越高越好。我自己用Primer Premier 5设计，大部分都是95分以上的才用。
如果是用Sybr Green，由于双链DNA都会引起荧光信号，所以尽量不要有错配、二聚体、发夹结构这些东西，在这里，这些比Tm值、GC含量还要重要些。实在免不了，那么其结合强度也不能高。可以看评分里面的AG值（如图），绝对值越大，结合强度越大。具体的我不是很清楚，只记得以前生物信息学上老师说过不能大于10。我自己有好几对引物的二聚体AG值在-6左右，用着倒是很正常。
另外，荧光定量PCR常用cDNA为模板来检测表达量，这种时候就需要避免基因组DNA的干扰。在引物设计上，有一些技巧可以避免基因组DNA得到扩增：1.让上下游引物中间隔着一个大的内含子，这样基因组DNA的产物由于太大，扩增效率很低。
2.让引物的5'端和3'在不同的外显子上，这样引物就不能结合到基因组DNA上啦。
以上就是本人在设计荧光定量PCR引物上的一些经验。引物到底好不好，最好还是要看荧光定量PCR的结果，看熔解曲线，如果只有单一的峰，说明产物很特异，引物可以用。
其他就是普通PCR引物的要求了，而这些只要看引物设计软件的评分就可以了，评分越高越好。我自己用Primer Premier 5设计，大部分都是95分以上的才用。
如果是用Sybr Green，由于双链DNA都会引起荧光信号，所以尽量不要有错配、二聚体、发夹结构这些东西，在这里，这些比Tm值、GC含量还要重要些。实在免不了，那么其结合强度也不能高。可以看评分里面的AG值（如图），绝对值越大，结合强度越大。具体的我不是很清楚，只记得以前生物信息学上老师说过不能大于10。我自己有好几对引物的二聚体AG值在-6左右，用着倒是很正常。
另外，荧光定量PCR常用cDNA为模板来检测表达量，这种时候就需要避免基因组DNA的干扰。在引物设计上，有一些技巧可以避免基因组DNA得到扩增：1.让上下游引物中间隔着一个大的内含子，这样基因组DNA的产物由于太大，扩增效率很低。
2.让引物的5'端和3'在不同的外显子上，这样引物就不能结合到基因组DNA上啦。
以上就是本人在设计荧光定量PCR引物上的一些经验。引物到底好不好，最好还是要看荧光定量PCR的结果，看熔解曲线，如果只有单一的峰，说明产物很特异，引物可以用。
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