用引物从酿酒酵母基因中扩增出adh2基因。将得到的片段用PstI/ XhoI酶切，并连接到PstI/ XhoI限制性质粒pBB1上。为构建质粒pBB1kivd和pBB1kivd-adh2，用引物从乳酸乳球菌中扩增kivd基因。将得到的片段用PstI酶切，连接到PstI限制性质粒pBB1和pBB1adh2上，得到质粒pBB1kivd和pBB1kivd-adh2。为构建质粒pBB1kivd-adhA，从谷氨酸棒状杆菌中扩增出kivd-adhA基因。得到的片段用SalI酶切，连接到SalI限制性质粒pBB1kivd。为了构建质粒pBB1pntAB，利用引物从pEKEx2-pntAB中扩增出含有pntAB基因的pntABbp片段。用PstI切割所得片段，克隆到PstI限制性质粒pBB1中。为了构建质粒pJC4ilvBNCD-pntAB，利用引物从质粒pBB1中扩增出pntAB基因（在Ptac启动子的控制下）。将得到的片段用Bst1107I酶切，连接到Bst1107I限制性质粒pJC4ilvBNCD上。
参考文献：Blombach B, Riester T, Wieschalka S, Ziert C, Youn JW, Wendisch VF, Eikmanns BJ. Corynebacterium glutamicum tailored for efficient isobutanol production. Appl Environ Microbiol. 2011 May;77(10):3300-10.
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用引物从酿酒酵母基因中扩增出adh2基因。将得到的片段用PstI/ XhoI酶切，并连接到PstI/ XhoI限制性质粒pBB1上。为构建质粒pBB1kivd和pBB1kivd-adh2，用引物从乳酸乳球菌中扩增kivd基因。将得到的片段用PstI酶切，连接到PstI限制性质粒pBB1和pBB1adh2上，得到质粒pBB1kivd和pBB1kivd-adh2。为构建质粒pBB1kivd-adhA，从谷氨酸棒状杆菌中扩增出kivd-adhA基因。得到的片段用SalI酶切，连接到SalI限制性质粒pBB1kivd。为了构建质粒pBB1pntAB，利用引物从pEKEx2-pntAB中扩增出含有pntAB基因的pntABbp片段。用PstI切割所得片段，克隆到PstI限制性质粒pBB1中。为了构建质粒pJC4ilvBNCD-pntAB，利用引物从质粒pBB1中扩增出pntAB基因（在Ptac启动子的控制下）。将得到的片段用Bst1107I酶切，连接到Bst1107I限制性质粒pJC4ilvBNCD上。
参考文献：Blombach B, Riester T, Wieschalka S, Ziert C, Youn JW, Wendisch VF, Eikmanns BJ. Corynebacterium glutamicum tailored for efficient isobutanol production. Appl Environ Microbiol. 2011 May;77(10):3300-10.
