为了构建pSWU30-cmR-XX系列质粒，我们使用质粒pKK232-8中不同类型的lox位点引物对扩增了与天然启动子连接的1.1kb氯霉素抗性基因。野生型loxP对分别由正向引物CmR WloxPAmHI和反向引物CmR W loxPXbaI引入。然后，用BamHI+XbaI消化PCR片段，直接连接到pSWU30中，得到质粒pSWU30-cmR-W5。分别用含有KpnI酶识别位点、XbaI酶识别位点和rrnT1终止子序列的引物CreF2和引物CreBT1R从705Cre质粒的模板中扩增出天然cre基因。带有rrnT1终止子的cre基因片段被KpnI+XbaI消化，并连接到pUC19，得到pUC19-cre。用引物对PcuF和PcuR从质粒pNG10A中扩增出铜诱导型启动子序列，然后用EcoRI+KpnI消化并连接到pUC19-cre上，得到pUC19-PcuoA-cre。通过EcoRI+XbaI消化和连接，将pUC19-PcuoA-cre的骨架转化为pBJ113，得到质粒pBJ113-PcuoA-cre。铜诱导型启动子序列起源于DK1622的基因组，因此质粒pBJ113-PcuoA-cre可以通过同源重组插入DK1622基因组。为了获得表达载体pMF1-cre-kanR，将质粒pZJY41用EcoRI+XbaI消化，并与pUC19-PcuoA-cre的EcoRI+XbaI片段连接。为了方便将载体pMF1-cre-kanR与黄原霉中的其他抗生素抗性载体结合使用，我们用四环素抗性基因（tetR）或氯霉素抗性基因替换卡那霉素抗性基因（kanR），以产生pMF1-cret-tetR和pMF1-cre-cmR。用引物扩增pMF1-cre-kanR的骨架，引物对分别位于pMF1-cre kanR中kan基因的上游和bla基因的下游。以pMAT3为模板扩增tetR基因。以pKK232-8为模板扩增cmR基因。扩增子和抗性基因片段都被沉淀，用SmaI消化并连接，然后电穿孔到大肠杆菌Top10中。

参考文献：Yang YJ, Singh RP, Lan X, Zhang CS, Li YZ, Li YQ, Sheng DH. Genome Editing in Model Strain Myxococcus xanthus DK1622 by a Site-Specific Cre/loxP Recombination System. Biomolecules. 2018 Nov 6;8(4):137.