使用引物分别对含有htrA和clpP的1.9-kb和1.7-kb DNA片段进行PCR扩增（。将PCR产物克隆到pGEM TEasy TA克隆载体（Promega）中。使用两组不同的引物从pUC4Km2扩增出Km抗性盒，将其克隆到BaeI PflMI消化/T4 DNA聚合酶钝化的pIB102中的htrA中，产生含有野生型loxP位点的pIB501（htrA:：loxP-Km loxP）和含有突变的loxP部位的pIB506（htrA：：lox71-Km-lox66）；两种产物均经限制性消化验证。使用引物从pUC Spec中扩增Sp抗性盒，并将其插入pIB143中的BbsI-ClaI消化和钝端clpP基因中，得到pIB507。质粒pIB501、pIB506和pIB507用NotI线性化，用于转化进入变形链球菌UA159。
参考文献：Banerjee A, Biswas I. Markerless multiple-gene-deletion system for Streptococcus mutans. Appl Environ Microbiol. 2008 Apr;74(7):2037-42.
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使用引物分别对含有htrA和clpP的1.9-kb和1.7-kb DNA片段进行PCR扩增（。将PCR产物克隆到pGEM TEasy TA克隆载体（Promega）中。使用两组不同的引物从pUC4Km2扩增出Km抗性盒，将其克隆到BaeI PflMI消化/T4 DNA聚合酶钝化的pIB102中的htrA中，产生含有野生型loxP位点的pIB501（htrA:：loxP-Km loxP）和含有突变的loxP部位的pIB506（htrA：：lox71-Km-lox66）；两种产物均经限制性消化验证。使用引物从pUC Spec中扩增Sp抗性盒，并将其插入pIB143中的BbsI-ClaI消化和钝端clpP基因中，得到pIB507。质粒pIB501、pIB506和pIB507用NotI线性化，用于转化进入变形链球菌UA159。
参考文献：Banerjee A, Biswas I. Markerless multiple-gene-deletion system for Streptococcus mutans. Appl Environ Microbiol. 2008 Apr;74(7):2037-42.
