用于植物乳杆菌423和蒙氏乳杆菌ST4SA的整合载体基于pNZ8048 Lc.lactis NICE系统质粒，该质粒含有PnisA-nisA基因启动子区、多克隆位点（MCS）、用于在LAB和大肠杆菌中复制的repC和repA复制基因、用于Cm抗性的cat基因和Lc.lactis-pepN基因的终止子序列。使用引物nisRK1和nisRK2从乳杆菌pNZ9000 gDNA中扩增nisK和nisR调控基因。将扩增产物用HindIII和XhoI消化，克隆到用相同的限制性内切酶消化的pNZ8048中，得到质粒pNZnisRK。使用引物mazF1和mazF2从分离自大肠杆菌DH5α的基因组DNA中扩增mazF毒素基因。使用NcoI和HindIII将产生的342bp扩增子克隆到pNZ8048和pNZnisRK的MCS中，分别产生pNZmazF和pNZmaxFnisRK。首先，结合EcoRI和XbaI消化位点，通过PCR获得包含munA ORF的完整同源区。用EcoRI/PvuII和HpaI/XbaI消化产生的扩增子，分别得到munA上游911 bp和下游633 bp的同源区。接下来，质粒pGKVCatFfucSTSA作为源DNA，通过PCR扩增产生的钝端2480 bp cat-ffuc基因盒将两个同源区域连接在一起。cat-ffuc基因盒包含氯霉素抗性的猫基因和来自Photinus pyralis的萤火虫荧光素酶基因（ffuc），该基因与强组成型E.munditii ldh基因（Pstldh）启动子融合。然后将这种cat-ffuc中断的munA区域克隆到EcoRI/XbaI双消化的pBluescriptKS克隆载体中，得到质粒pKSmunA:：CatFfuc。最后，从pKSNmunA:：CatFfuc中PCR扩增出两侧有munA上游/下游同源区（4024 bp）的cat-ffuc基因盒，并将其克隆到StuI线性化pNZmazFnisRKerm质粒中，该质粒同时含有cat和erm抗生素抗性基因，产生质粒pNZKOmunA:：CatFfuc。

参考文献：Van Zyl WF, Dicks LMT, Deane SM. Development of a novel selection/counter-selection system for chromosomal gene integrations and deletions in lactic acid bacteria. BMC Mol Biol. 2019 Mar 29;20(1):10.