首先获得pgdS的gRNA。将gRNA的上游（pgdS-N20-F）和下游（pgdSN-20-R）引物退火，然后插入质粒pBAC-Cas9中，形成pBAC-Cas9-N20-pgdS。然后，扩增pgdS基因的引物上游同源臂和引物下游同源臂。随后，使用In-Fusion克隆方法将这两个片段连接在一起。最后，将同源臂和质粒pBAC-Cas9-N20-pgdS用SfI限制性内切酶（Termo Scientifc）消化并连接，得到敲除质粒pBAC-Cass9-N20-pgdS-und-down。如前所述，将敲除质粒转化到龙舌兰芽孢杆菌。
参考文献：Wang D, Fu X, Zhou D, Gao J, Bai W. Engineering of a newly isolated Bacillus tequilensis BL01 for poly-γ-glutamic acid production from citric acid. Microb Cell Fact. 2022 Dec 29;21(1):276.
技术服务 Technology Services
联系我们
CONTACT US
-
0574-87917803
服务热线 -
testobio@163.com
邮箱
首先获得pgdS的gRNA。将gRNA的上游（pgdS-N20-F）和下游（pgdSN-20-R）引物退火，然后插入质粒pBAC-Cas9中，形成pBAC-Cas9-N20-pgdS。然后，扩增pgdS基因的引物上游同源臂和引物下游同源臂。随后，使用In-Fusion克隆方法将这两个片段连接在一起。最后，将同源臂和质粒pBAC-Cas9-N20-pgdS用SfI限制性内切酶（Termo Scientifc）消化并连接，得到敲除质粒pBAC-Cass9-N20-pgdS-und-down。如前所述，将敲除质粒转化到龙舌兰芽孢杆菌。
参考文献：Wang D, Fu X, Zhou D, Gao J, Bai W. Engineering of a newly isolated Bacillus tequilensis BL01 for poly-γ-glutamic acid production from citric acid. Microb Cell Fact. 2022 Dec 29;21(1):276.
