使用引物从酿酒酵母的基因组DNA中PCR扩增TDH3启动子和CYC1终止子。使用引物从pUC57-Lm.ldhA和pRSII405中PCR扩增出Lm.ldhA和HIS3选择性标记。通过重叠延伸PCR将这四个DNA片段组装成单个片段。将所得盒连接到pJET1.2上，得到pJET-DeltaUp-LmLDH-His3-DeltaDown。为了构建用于基因组整合的pRP1 gRNA delta，使用引物从pRP1 gRNA-handle-RPR1t中PCR扩增gRNA delta片段。将0.13kb的PCR扩增子凝胶纯化，并通过pRP1 gRAN-handle-RRP1t的HindIII/XhoI位点连接，得到pRP1 gRA-delta。为了构建用于特定基因缺失的pArray质粒，使用CRISPR RGEN工具设计了每个基因缺失的gpd1、2和adh1特异性crRNA。crRNA阵列包含每个靶基因的基因特异性crRNA以及直接重复序列和与质粒骨架pUDE735同源的侧翼序列，由GenScript合成，并使用引物crRNA-F和crRNA-R扩增。质粒骨架pUDRE735是通过使用引物tSUP4-F和pCAS9-R对pUDE835进行PCR扩增制备的。合成的片段与质粒骨架p6DE735的同源重组产生了用于GPD1和gpd2基因缺失的pArray-GPD1,2质粒和用于ADH1基因缺失的nArray-ADH1质粒。
参考文献：Feng X, Jiang L, Han X, Liu X, Zhao Z, Liu H, Xian M, Zhao G. Production of D-lactate from glucose using Klebsiella pneumoniae mutants. Microb Cell Fact. 2017 Nov 21;16(1):209.
技术服务 Technology Services
联系我们
CONTACT US
-
0574-87917803
服务热线 -
testobio@163.com
邮箱
使用引物从酿酒酵母的基因组DNA中PCR扩增TDH3启动子和CYC1终止子。使用引物从pUC57-Lm.ldhA和pRSII405中PCR扩增出Lm.ldhA和HIS3选择性标记。通过重叠延伸PCR将这四个DNA片段组装成单个片段。将所得盒连接到pJET1.2上，得到pJET-DeltaUp-LmLDH-His3-DeltaDown。为了构建用于基因组整合的pRP1 gRNA delta，使用引物从pRP1 gRNA-handle-RPR1t中PCR扩增gRNA delta片段。将0.13kb的PCR扩增子凝胶纯化，并通过pRP1 gRAN-handle-RRP1t的HindIII/XhoI位点连接，得到pRP1 gRA-delta。为了构建用于特定基因缺失的pArray质粒，使用CRISPR RGEN工具设计了每个基因缺失的gpd1、2和adh1特异性crRNA。crRNA阵列包含每个靶基因的基因特异性crRNA以及直接重复序列和与质粒骨架pUDE735同源的侧翼序列，由GenScript合成，并使用引物crRNA-F和crRNA-R扩增。质粒骨架pUDRE735是通过使用引物tSUP4-F和pCAS9-R对pUDE835进行PCR扩增制备的。合成的片段与质粒骨架p6DE735的同源重组产生了用于GPD1和gpd2基因缺失的pArray-GPD1,2质粒和用于ADH1基因缺失的nArray-ADH1质粒。
参考文献：Feng X, Jiang L, Han X, Liu X, Zhao Z, Liu H, Xian M, Zhao G. Production of D-lactate from glucose using Klebsiella pneumoniae mutants. Microb Cell Fact. 2017 Nov 21;16(1):209.
