使用KOD-Plus-mu-tagenesis试剂盒构建获得ade6-1450区域的cas9表达质粒tar。pMZ374用作引物对F-ade6-1450+R-ade6-1450的模板。所得质粒命名为pMZ374-ade6。用引物通过PCR分别扩增上游和下游区域。扩增片段通过重叠延伸PCR与引物对结合。使用pDUAL-HFG31（RIKEN BRC）作为模板，使用引物通过PCR扩增gfp表达盒。用引物对分别扩增上游和下游区域。通过重叠延伸PCR将三个扩增片段与引物偶联，产生HR供体DNA，用于引入盒的染色体ade6位点，在cam1启动子的控制下指导gfp的表达。为了构建d-ldh表达盒，使用细菌基因组DNA通过PCR扩增植物乳杆菌NCIMB 8826的d-ldh编码基因。将PCR产物克隆到pDUAL-FFH61的NheI和SalI位点，所得质粒命名为pDUAL-FF H61-dLDH。然后通过PCR扩增d-ldh表达盒。用引物对分别扩增上游和下游区域。通过重叠延伸PCR将三个扩增片段与引物偶联，得到HR供体DNA，用于引入d-ldh表达盒的染色体gut2区域。使用引物对类似地构建了用于引入d-ldh表达盒染色体adh8区域的HR供体DNA。为了构建bgl（β-葡萄糖苷酶）表达盒，将来自粟酒酵母的hsp90启动子与引物对拼接。将拼接片段克隆在pDUAL-FFH61的SpeI和SacI位点之间。接下来，扩增来自粟酒链球菌的nmt1终止子。将扩增片段克隆在上述质粒的XhoI和NotI位点之间，所得质粒命名为pDUAL-hsp。然后，使用pDUAL SPBC359.04c_BGL作为模板，用引物扩增编码与锚定蛋白SPBC359.084c融合的尖曲霉β-葡萄糖苷酶的基因。扩增片段克隆在pDUAL-hsp的XhoI和NotI位点之间；所得质粒命名为pDUAL-hsp-SPBC359.04c_BGL。使用该质粒作为模板，使用引物对通过PCR产生三个片段。扩增的片段通过重叠延伸PCR与引物偶联，产生HR供体DNA，用于引入bgl表达盒的染色体gut2区域。

参考文献：Ozaki A, Konishi R, Otomo C, Kishida M, Takayama S, Matsumoto T, Tanaka T, Kondo A. Metabolic engineering of Schizosaccharomyces pombe via CRISPR-Cas9 genome editing for lactic acid production from glucose and cellobiose. Metab Eng Commun. 2017 Aug 24;5:60-67.