使用引物从野生型谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基因组中扩增gltX、hemA和hemL基因。将三个扩增子连接到pUC19上，根据Gibson组装方法用SalI消化pUC19，其中包括T5核酸外切酶、Phusion DNA聚合酶和Taq DNA连接酶]。使用引物从谷氨酸梭菌ATCC 13032的基因组中克隆了gltX、hemA和hemL。为此，使用带有突变的引物在N-末端Thr-2和Leu-3之间插入编码Lys的两个密码子（AAGAAG）。使用根据野生型大肠杆菌MG1655基因组序列设计的引物扩增一个hemL基因，并使用根据C.glutami cum ATCC 13032基因组顺序设计的引物cgheml-F和cgheml-R克隆hemL。这些扩增子包含30 bp的重叠，并单独或一起连接成pECXK99E，使用Gibson组装法用KpnI切割pECXK99。使用引物从大肠杆菌MG1655和谷氨酸梭菌ATCC 13032的基因组中克隆gltX基因，然后使用Gibson组装将其连接到用PstI消化的pSEAL中。大肠杆菌DH5α作为分子克隆和质粒构建的宿主。由pK18obsacB构建的诱导型自杀载体pKJL用于将ASV和AAV标签添加到谷氨酸杆菌ATCC 13032基因组编码的ALAD的C末端。
参考文献：Yu X, Jin H, Liu W, Wang Q, Qi Q. Engineering Corynebacterium glutamicum to produce 5-aminolevulinic acid from glucose. Microb Cell Fact. 2015 Nov 17;14:183. doi: 10.1186/s12934-015-0364-8. PMID: 26577071; PMCID: PMC4650169.
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参考文献：Yu X, Jin H, Liu W, Wang Q, Qi Q. Engineering Corynebacterium glutamicum to produce 5-aminolevulinic acid from glucose. Microb Cell Fact. 2015 Nov 17;14:183. doi: 10.1186/s12934-015-0364-8. PMID: 26577071; PMCID: PMC4650169.
