使用引物从pCCI-PspXI中扩增PspXI基因，并将扩增子连接到EcoRI/NotI消化的pGAPHyg上，得到pGAPHyg-PspXI。使用引物从pCCI-LpXI中扩增LpXI基因，并将扩增子连接到EcoRI/NotI消化的pGAPHyg上，得到pGAPHyg-LpXI。使用引物PpXKS1-EcoRI-F和PpXK1-NotI-R从巴斯德毕赤酵母KM71基因组DNA中扩增出来自巴斯德毕氏毕赤酵母的木聚糖酶并将扩增子连接到EcoRI/NotI消化的pGAPZ上，得到pGAPZ-PpXKS。使用引物从巴斯德毕赤酵母KM71基因组DNA中扩增出GCW14的启动子。使用引物从pGAPZ PpXKS中扩增出PpXKS1，使用引物从pGAPHyg-PspXI_pGCW14-PpXKS 1中扩增pGCW14-PpXK1盒。将扩增子连接到NsiI消化的pGAPHyg LpXI_pGC W14-PpILKS1上。使用引物从巴斯德毕赤酵母KM71基因组DNA中扩增pGCW14启动子。使用引物通过重叠延伸PCR将两个扩增子连接起来，并连接到BglII消化的pGAPZ-LlkivD-T2A-ScADH7上，得到pGAPZ-LlkivD-T2D-ScADH7_pGCW14-PpIlv5-T2A1-PpIlv3。
参考文献：Bumrungtham P, Promdonkoy P, Prabmark K, Bunterngsook B, Boonyapakron K, Tanapongpipat S, Champreda V, Runguphan W. Engineered Production of Isobutanol from Sugarcane Trash Hydrolysates in Pichia pastoris. J Fungi (Basel). 2022 Jul 25;8(8):767.
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使用引物从pCCI-PspXI中扩增PspXI基因，并将扩增子连接到EcoRI/NotI消化的pGAPHyg上，得到pGAPHyg-PspXI。使用引物从pCCI-LpXI中扩增LpXI基因，并将扩增子连接到EcoRI/NotI消化的pGAPHyg上，得到pGAPHyg-LpXI。使用引物PpXKS1-EcoRI-F和PpXK1-NotI-R从巴斯德毕赤酵母KM71基因组DNA中扩增出来自巴斯德毕氏毕赤酵母的木聚糖酶并将扩增子连接到EcoRI/NotI消化的pGAPZ上，得到pGAPZ-PpXKS。使用引物从巴斯德毕赤酵母KM71基因组DNA中扩增出GCW14的启动子。使用引物从pGAPZ PpXKS中扩增出PpXKS1，使用引物从pGAPHyg-PspXI_pGCW14-PpXKS 1中扩增pGCW14-PpXK1盒。将扩增子连接到NsiI消化的pGAPHyg LpXI_pGC W14-PpILKS1上。使用引物从巴斯德毕赤酵母KM71基因组DNA中扩增pGCW14启动子。使用引物通过重叠延伸PCR将两个扩增子连接起来，并连接到BglII消化的pGAPZ-LlkivD-T2A-ScADH7上，得到pGAPZ-LlkivD-T2D-ScADH7_pGCW14-PpIlv5-T2A1-PpIlv3。
参考文献：Bumrungtham P, Promdonkoy P, Prabmark K, Bunterngsook B, Boonyapakron K, Tanapongpipat S, Champreda V, Runguphan W. Engineered Production of Isobutanol from Sugarcane Trash Hydrolysates in Pichia pastoris. J Fungi (Basel). 2022 Jul 25;8(8):767.
