为了构建无标记编辑质粒pJQ，使用有毒mazF基因和抗生素zeocin抗性基因作为选择标记。首先，将大肠杆菌的mazF基因扩增并克隆到pPIC9K的BamHI和AgeI位点。然后，从获得的质粒中扩增pAOX mazF表达盒，通过重叠PCR与ZeoR表达盒融合，克隆到pEASY-T3载体中，创建质粒pJQ。本研究中使用的所有基因编辑质粒都是基于母载体pJQ构建的。为了构建无标记基因缺失质粒，从巴斯德毕赤酵母GS115的基因组DNA中扩增出三个同源臂，即上臂、短臂、下臂，并分别插入pJQ载体的SacII（上臂）和SpeI（短臂和下臂）位点。根据基因组编辑要求，短臂序列与上臂3'端序列同源。为了构建基因替换或敲入质粒，将货物基因插入无标记基因缺失质粒的短臂和下臂之间。从巴斯德毕赤酵母GS115的基因组DNA中扩增pGAP、pGUT1和pHHX1。分别使用酿酒酵母和大肠杆菌的基因组DNA通过PCR获得ScIPS和EcIMP基因。
参考文献：Zhang Q, Wang X, Luo H, Wang Y, Wang Y, Tu T, Qin X, Su X, Huang H, Yao B, Bai Y, Zhang J. Metabolic engineering of Pichia pastoris for myo-inositol production by dynamic regulation of central metabolism. Microb Cell Fact. 2022 Jun 3;21(1):112.
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为了构建无标记编辑质粒pJQ，使用有毒mazF基因和抗生素zeocin抗性基因作为选择标记。首先，将大肠杆菌的mazF基因扩增并克隆到pPIC9K的BamHI和AgeI位点。然后，从获得的质粒中扩增pAOX mazF表达盒，通过重叠PCR与ZeoR表达盒融合，克隆到pEASY-T3载体中，创建质粒pJQ。本研究中使用的所有基因编辑质粒都是基于母载体pJQ构建的。为了构建无标记基因缺失质粒，从巴斯德毕赤酵母GS115的基因组DNA中扩增出三个同源臂，即上臂、短臂、下臂，并分别插入pJQ载体的SacII（上臂）和SpeI（短臂和下臂）位点。根据基因组编辑要求，短臂序列与上臂3'端序列同源。为了构建基因替换或敲入质粒，将货物基因插入无标记基因缺失质粒的短臂和下臂之间。从巴斯德毕赤酵母GS115的基因组DNA中扩增pGAP、pGUT1和pHHX1。分别使用酿酒酵母和大肠杆菌的基因组DNA通过PCR获得ScIPS和EcIMP基因。
参考文献：Zhang Q, Wang X, Luo H, Wang Y, Wang Y, Tu T, Qin X, Su X, Huang H, Yao B, Bai Y, Zhang J. Metabolic engineering of Pichia pastoris for myo-inositol production by dynamic regulation of central metabolism. Microb Cell Fact. 2022 Jun 3;21(1):112.
