辅助质粒HZP/HGP/HHP sgRNA-IntX由通用骨架、抗性基因表达盒、sgRNA支架和两个BsaI限制性位点组成。通过Gibson Assembly或一步法将PCR扩增的基因序列和sgRNA序列克隆到相应的限制性内切酶位点。编码2-吡喃酮合酶Gh2PS的基因、编码木酮糖-5-磷酸特异性磷酸酮醇酶的基因xPK和编码磷酸转乙酰酶的基因PTA分别来自非洲菊、肠系膜明串珠菌和克鲁维梭菌。木糖还原酶编码基因XR、木糖醇脱氢酶编码基因XDH和木聚糖酶编码基因XKS均来自斯氏链霉菌。上述所有异质基因都经过密码子优化和化学合成。从酿酒酵母基因组中通过PCR扩增编码乙酰辅酶A羧化酶的基因ScACC1，其中有两个突变（Ser659A和Ser1157A），以尽量减少SNF1介导的蛋白质降解。构建了6个具有不同基因组整合位点的Gh2PS整合辅助质粒，用于Gh2PS的多拷贝整合。Int39-ScACC1*供体是为了在Int39上整合ScACC1*而构建的。Int56 XR XDH供体是为了在Int56上整合XR和XDH而构建的。Int1-XKS供体是为了在Int1上整合XKS而构建的。构建Int35-xPK供体和Int59-PTA供体，分别用于在Int35和Int59上整合xPK和PTA。基因缺失辅助质粒包括一个通用骨架、一个约500 bp的上游和下游同源臂序列。使用Gibson组装法将PCR扩增的同源臂序列拼接在一起。构建DetPFK1供体和DetPYK1供体分别用于缺失pfk1和pyk1。辅助质粒HZP-gRNA-DePFK1/DetPYK1包含一个通用骨架、zeocin抗性基因表达盒、sgRNA支架和与pfk1/pyk1基因相对应的20bp sgRNA序列。
参考文献：Feng L, Xu J, Ye C, Gao J, Huang L, Xu Z, Lian J. Metabolic Engineering of Pichia pastoris for the Production of Triacetic Acid Lactone. J Fungi (Basel). 2023 Apr 20;9(4):494.
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辅助质粒HZP/HGP/HHP sgRNA-IntX由通用骨架、抗性基因表达盒、sgRNA支架和两个BsaI限制性位点组成。通过Gibson Assembly或一步法将PCR扩增的基因序列和sgRNA序列克隆到相应的限制性内切酶位点。编码2-吡喃酮合酶Gh2PS的基因、编码木酮糖-5-磷酸特异性磷酸酮醇酶的基因xPK和编码磷酸转乙酰酶的基因PTA分别来自非洲菊、肠系膜明串珠菌和克鲁维梭菌。木糖还原酶编码基因XR、木糖醇脱氢酶编码基因XDH和木聚糖酶编码基因XKS均来自斯氏链霉菌。上述所有异质基因都经过密码子优化和化学合成。从酿酒酵母基因组中通过PCR扩增编码乙酰辅酶A羧化酶的基因ScACC1，其中有两个突变（Ser659A和Ser1157A），以尽量减少SNF1介导的蛋白质降解。构建了6个具有不同基因组整合位点的Gh2PS整合辅助质粒，用于Gh2PS的多拷贝整合。Int39-ScACC1*供体是为了在Int39上整合ScACC1*而构建的。Int56 XR XDH供体是为了在Int56上整合XR和XDH而构建的。Int1-XKS供体是为了在Int1上整合XKS而构建的。构建Int35-xPK供体和Int59-PTA供体，分别用于在Int35和Int59上整合xPK和PTA。基因缺失辅助质粒包括一个通用骨架、一个约500 bp的上游和下游同源臂序列。使用Gibson组装法将PCR扩增的同源臂序列拼接在一起。构建DetPFK1供体和DetPYK1供体分别用于缺失pfk1和pyk1。辅助质粒HZP-gRNA-DePFK1/DetPYK1包含一个通用骨架、zeocin抗性基因表达盒、sgRNA支架和与pfk1/pyk1基因相对应的20bp sgRNA序列。
参考文献：Feng L, Xu J, Ye C, Gao J, Huang L, Xu Z, Lian J. Metabolic Engineering of Pichia pastoris for the Production of Triacetic Acid Lactone. J Fungi (Basel). 2023 Apr 20;9(4):494.
