用MfeI和PstI消化PCR产物，并将其连接到用EcoRI和PstI消化的pEP2中，以获得pKS122。用引物从pZA31克隆标记基因，用SalI和NotI消化，并连接到用相同酶切割的pKS122中，得到pKS133。转录eftu基因的eftu启动子用引物K717和K718从基因组DNA（ATCC 13032）中扩增，用PstI和SalI消化，并连接到用相同限制性内切酶切割的pKS133中以获得pKS140。为了克隆枯草芽孢杆菌的alsS，用引物从pSA69扩增该基因，用XhoI和SalI消化，并连接到用SalI切割的pKS140中以获得pKS149。分别用引物K764和K765以及K766和K767从基因组DNA（ATCC 13032）中通过PCR扩增谷氨酸梭菌的IlvC和ilvD。通过顺序重叠延伸将PCR产物融合在一起，用XhoI和NotI消化，并连接到用SalI和NotI切割的pKS149中，得到pKS1502。pKS154是通过扩增pSA55中乳双歧杆菌的kivd，用NotI和SpeI消化PCR产物，并连接到用相同限制性内切酶切割的pKS152中构建的。从基因组DNA中扩增谷氨酸棒杆菌的adhA，将PCR产物用SpeI消化并连接到用相同酶切割的pKS1504中以获得pKS167。为了构建pKS160，用引物扩增eftu启动子，用PstI和SalI消化，并连接到用相同酶切割的pKS122中。使用引物K976+K977和K978+K979构建质粒pΔpyc，从基因组DNA中扩增pyc的末端区域，以构建pyc片段。同样，使用K972+K973和K974+K975构建质粒pΔppc，使用K960+K961和K962+K963构建质粒p△aceE，使用引物K950+K951和K952+K953构建质粒pΔpgi，使用K21+K22和K23+K24构建质粒pδilvE。通过连续重叠延伸将两种PCR产物融合在一起，用MfeI和HindIII（pyc、aceE和pgi片段）或HindIII和EcoRI（ppc和ilvE片段）消化，并连接到用EcoRI和HindIII切割的pK19mobsacB中。

参考文献：Smith KM, Cho KM, Liao JC. Engineering Corynebacterium glutamicum for isobutanol production. Appl Microbiol Biotechnol. 2010 Jul;87(3):1045-55.