使用质粒pETM6-At3GT-m-PhANS通过PCR扩增获得矮牵牛的ANS基因和拟南芥的3GT。使用质粒pMAL-c2X-PhANS或pET-His6-SUMO-TEV-LIC克隆载体扩增麦芽糖结合蛋白（MBP）标签或小泛素样修饰物（SUMO）标签。通过iIntegrated DNA技术合成了ANS和3GT的密码子优化基因。通过重叠延伸PCR实现了MBP或SUMO标签与野生型或密码子优化的3GT基因的融合。为了构建操纵子结构的表达质粒，首先使用传统的基于限制性内切酶的克隆将不同版本的3GT基因插入pEC-XK99E，然后插入ANS基因。通过将由rrnB终止子和tac启动子组成的片段插入上述操纵子结构的质粒中，构建了单体电子形式的ANS和3GT表达质粒。为了获得在谷氨酸梭菌中表达3GT和ANS融合基因的质粒，使用质粒pCDF-3AO作为模板扩增3AO，随后分别通过EcoRI和SalI克隆到表达质粒pEC-XK99E和pZ8-1中。其他表达质粒是在pZM1的基础上构建的，pZM1是根据构建ePathBrick载体pETM6的原理从质粒pZ8-Ptac中创建的。从BL21-Star（DE3）或谷氨酸梭菌ATCC 13032的基因组DNA中扩增大肠杆菌（cmk、ndk、galU、pgm和ycjU）或谷氨酸杆菌（galU1和pgm）中UDP-葡萄糖生物合成途径中的Te基因，该基因组DNA由Pure Link genomic DNA Kit提取。然后将每个基因克隆到pZM1中，并使用先前发表的方法以单顺反子形式组装。
参考文献：Zha J, Zang Y, Mattozzi M, Plassmeier J, Gupta M, Wu X, Clarkson S, Koffas MAG. Metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum for anthocyanin production. Microb Cell Fact. 2018 Sep 14;17(1):143.
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参考文献：Zha J, Zang Y, Mattozzi M, Plassmeier J, Gupta M, Wu X, Clarkson S, Koffas MAG. Metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum for anthocyanin production. Microb Cell Fact. 2018 Sep 14;17(1):143.
