用引物从谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基因组DNA中分别扩增gabT和gabD。利用引物从恶臭假单胞菌KT2440的基因组DNA中分别扩增gabT和gabD。用引物从施氏假单胞菌ATCC 17588的基因组DNA中分别扩增gabT和gabD。用引物从丁香假单胞菌DSM 50281的基因组DNA中分别扩增gabT和gabD。通过Gibson组装将gabTD操纵子克隆到用BamHI消化的载体pECXT99A中，得到载体pECX499A-gabTDCg、pECXT99-gabTDPpu、pECXT99A-gabTDPstu和pECXT99A-gabTDIPsyr。使用引物从谷氨酸梭菌ATCC 13032的基因组DNA中通过PCR扩增gdh基因的上下游区域。通过交叉PCR将上下PCR片段与引物对GDHA/GDHD融合，并通过连接克隆到用SmaI消化的载体pK19mobsacB中。使用引物过菌落PCR验证阳性克隆。将所得载体pK19mobsacB-gdh转移到大肠杆菌S17-1中。通过两步同源重组方法从谷氨酸棒杆菌中删除sugR、ldhA、snaA、cgmA和gdh基因。使用大肠杆菌S17-1通过接合将所有pK19mobsacB载体转移到谷氨酸梭菌菌株中。
参考文献：Pérez-García F, Jorge JMP, Dreyszas A, Risse JM, Wendisch VF. Efficient Production of the Dicarboxylic Acid Glutarate by Corynebacterium glutamicum via a Novel Synthetic Pathway. Front Microbiol. 2018 Oct 30;9:2589.
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参考文献：Pérez-García F, Jorge JMP, Dreyszas A, Risse JM, Wendisch VF. Efficient Production of the Dicarboxylic Acid Glutarate by Corynebacterium glutamicum via a Novel Synthetic Pathway. Front Microbiol. 2018 Oct 30;9:2589.
