合成编码mcr的mcr基因并引入了三个已报道的点突变（N940V、K1106W、S1114R）以提高酶活性。通过PCR扩增基因mcr，然后消化并连接到载体pEC-XK99E的相应位点。类似地构建质粒pEC-mcr*、pEC-N-C、pEC-N-C*和pEC-C*-N。为了构建质粒pEC-mbp-mcr*，用含有mbp序列的正向引物扩增mcr*基因，然后将所得片段消化并连接到载体pEC-XK99E的相应位点。质粒pEC-his mcr*的构建类似。为了构建质粒pEC-sod-N-C*，从谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基因组中扩增出sod基因的启动子和RBS序列，并将其与从pEC-N-C*中扩增出的N-C*序列融合。将所得片段和不含启动子Ptrc和基因lacIq的pEC-XK99E线性片段一起消化并连接以构建载体。类似地构建质粒pEC-H36-N-C*。为了构建质粒pEC-sod*-mbp-N-C*，用含有mbp序列的正向引物扩增N-C*序列。将所得片段与pEC-sod-N-C*的线性片段一起消化并连接以构建载体。所有构建体都使用RBS序列AAAGGAGGACAACC，除了位于Psod后面的基因，其RBS序列与谷氨酸梭菌ATCC 13032中的sod基因相同。没有启动子替代的质粒需要异丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）来诱导表达。谷氨酸梭菌的基因组编辑是通过使用自杀质粒pD-sacB的两步同源重组实现的。为了替换gltA的天然启动子，通过PCR扩增gltA启动子的上游和下游序列，并将其与启动子P1融合，然后消化并连接到载体pD-sac B的相应位点。类似地构建了质粒pD-sacB-P5-gltA和pD-scacB-P7-gltA。为了将突变引入accBC和accD1的fasO位点，扩增accBC fasO位点侧翼区域并进行相关修饰，用PCR融合，然后将融合片段消化并连接到载体pD-sac B的相应位点。类似地构建了质粒pD-sacB-fasO（M）-accD1。

参考文献：Chang Z, Dai W, Mao Y, Cui Z, Zhang Z, Wang Z, Ma H, Chen T. Enhanced 3-Hydroxypropionic Acid Production From Acetate via the Malonyl-CoA Pathway in Corynebacterium glutamicum. Front Bioeng Biotechnol. 2022 Jan 13;9:808258.